琼脂糖凝胶电泳检测DNA.ppt

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一、实验原理
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双涟DNA 几乎具有等量净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA 分子本身的大小和构型。
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一、实验原理
具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA 分子。
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二、实验仪器
1. 恒温培养箱
2 .琼脂糖凝胶电泳系统
3 .台式离心机
4 .高压灭菌锅
5 .紫外线透射仪
6 .凝胶成像系统
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三、实验试剂
dye (%溴酚兰+40%蔗糖水溶液)

:需1g溴化乙锭
:5×TBE贮液2L:108g Tris-base、
55g硼酸、40ml ()
disodium·2H2O
:30g
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四、实验步骤
1. 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;
2. 调整好梳子的高度;
3. g琼脂糖于30 ml ×TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完
全溶解,冷却至45-50ºC时倒入制胶板中;
4. 凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;
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四、实验步骤
5. 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中;
DNA 5µl + ddH2O 3µl + 溴酚蓝2µl 共10µ tube中混合后点样;
6. 将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;
7. 电泳完成后切断电源,取出凝胶, µg/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色10-15 min,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。
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五、主要事项
:
a . DNA分子大小迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA)
b. 琼脂糖浓度:logU=logU0 Kr胶浓度,U为迁移率,U0 为DNA的自由电泳迁移率,为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNA
Agarose: %: 1-30 kb; %: -12 kb
%: -7 kb; %: -3 kb
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五、主要事项
c. DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。
d. 所加电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm
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五、主要事项
e. 碱基组成与温度:一般影响不大4 -30 ℃
f. 嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中)
g. 电泳缓冲液(×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般