氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性.doc

实验三氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性一、实验目的1、了解氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本原理。2、掌握氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本操作方法。二、实验原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。三、材料、仪器设备及试剂(一)材料水稻或小麦等植物叶片。(二)仪器设备高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光灯(反应试管处照度为4000Lx),试管或指形管数支。(三)试剂(1)()。+。(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:。(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液:,避光保存。(4)100µmol/LEDTA-Na2溶液:-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。(5)20µmol/L核黄素溶液:,避光保存。四、实验步骤1、酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉),加1ml预冷的磷酸缓液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为4ml。取4ml于4℃10000r/min离心20min上清液即为SOD粗提液。2、显色反应取10mL试管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下表加入各种溶液:各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处,其他各管于4000lx日光下反应20min(要各管受光情况一致,温度高,时间缩短,低时延长)。3、SOD活性测定与计算至反应结束后,全部移入暗处,以不照光的对照管作空白,分别测定其他各管的吸光度。注意:用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零,各试剂按比例混合好(++++),再加100ul酶液,。