免疫共沉淀技术.ppt

免疫共沉淀技术
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实验室讨论
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Part 1: IP
Part 2: CO-IP
THE END
Part 3: CO-IP与质谱分析
Part 4: 应用
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免疫沉淀定义
Part 1:IP
免疫沉淀(immunoprecipitation IP)是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体可与抗原特异性结合的特性,将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来。
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免疫沉淀步骤
Part 1:IP
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G),通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
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免疫沉淀原理图解
Part 1:IP
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免疫共沉淀定义
Part 2:CO-IP
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
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当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x,那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
免疫共沉淀原理
Part 2:CO-IP
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免疫共沉淀原理图解
Part 2:CO-IP
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蛋白A , 蛋白B
抗A抗体C进行洗脱
抗B抗体D进行验证
IP C A
CO-IP C A+B D
Part 2:CO-IP
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相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
优点
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