免疫共沉淀技术.ppt

威斯腾生物技术中心免疫共沉淀技术定义及原理操作流程优点和不足注意事项应用及实例展望定义及原理免疫共沉淀定义免疫共沉淀( Co-Immunoprecipitation,CO-IP) 也称免疫共吸附或免疫下拉技术,能够从细胞裂解物中特异性的分离并富集目标蛋白。 CO-IP 是通过抗原抗体之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法。也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的偶联于 sepharose beads 上的 proteinA/G, 与细胞中的抗体结合,形成一种复合物:目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗体-proteinA/G ,经过变性凝胶电泳,复合物分开。最后通过免疫印迹或质谱检测目的蛋白。原理流程示意图操作流程免疫共沉淀实验流程(1) 蛋白样品准备(如果为细胞样品需先裂解) (2) 抗原抗体结合反应( 3)Protein A/G 与抗原抗体复合物结合(4) 免疫复合物与 protein A/G 解离( 2%SDS 煮沸处理) (5) 分析鉴定( Western Blot 或质谱分析) 实验流程如图所示优点和不足优点 ,可以避免人为影响。缺点和局限性 : 免疫共沉淀实验用途非常广泛,但一般主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩,为 SDS-PAGE 和 MS 质谱分析鉴定准备样品。应用范围: p53 相结合蛋白的分离和鉴定 P53 基因是一种人体抑癌基因,人体癌症一半由于该基因突变失活 P53 抗体与 HEN1 和 HEN2 细胞总蛋白进行免疫共沉淀。 -PAGE 分离免疫沉淀复合物 p53 结合蛋白条带,酶解后进行电喷雾串联质谱分析,得到相应肽列标签