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南方医科大学
博士学位论文
常见深部念珠菌感染实时荧光PCR检测技术的研究及临床应用
姓名:龙燕
申请学位级别:博士
专业:临床检验诊断学
指导教师:王前
201106
常见深部念珠菌感染实时荧光��检测技术的研究及临床应用博士研究生:龙燕指导教师:王前摘要首位,高达�%��ァ6嗉乙皆鹤柿咸崾景咨�钪榫�⒐饣�钪榫�⑷却�钪�相似,导致早期诊断困难,抗真菌治疗延迟。而且深部念珠菌感染病情凶险,近年来,由于免疫功能下降人群,包括恶性肿瘤、血液病、艾滋病、��、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、长期吸毒等发病增加:广谱抗生素、免疫抑制齐�、皮质类固醇激素在临床上广泛应用;器官移植、导管插管、介入治疗等新技术的普遍开展,使深部真菌感染的发病率急剧上升,成为院内感染死亡的主要原因之一。其中念珠菌感染最常见。�����昝拦���皆毫�续�甑募嗖庾柿媳砻鳎�钪榫�苎V⒃谝皆貉T葱愿腥局芯拥�位,病死率居菌、克柔念珠菌四种念珠菌临床分离率较高。由于深部念珠菌感染初期症状不明显,临床表现缺乏特征性,与其他感染发展迅速,贻误治疗时机常致患者死亡,念珠菌血症若不治疗死亡率可以达到�%��ィ�殉晌0�滩』颊叩闹饕K劳鲈�颉R虼丝焖佟⒚舾小⑻匾斓丶�ú�原菌对于�俅材钪榫�腥镜恼锒虾椭瘟凭哂兄匾5囊庖澹�芟灾�岣呋�嵝哉�菌感染患者的生存率。由于念珠菌属中不同的菌种与菌株对不同抗真菌药物的敏感性有一定差异,例如白色念珠菌、热带念珠菌及近平滑念珠菌对氟康唑保持�%��サ拿�感性,而克柔念珠菌对其天然耐药,医生在临床用药的选择上必须借鉴菌种鉴定的结果,不合理的用药不仅不能消除感染,反而会增加药物的选择压力使耐博士学位论文
药菌株凸显出来成多娃要致病菌株,造成较严重的临床感染,增加治疗的难度。因而在治疗之前对致病念珠菌进行鉴定具有重要意义。目前,对于深部念珠菌感染,传统的形态学检查、真菌培养和生化鉴定,通常周期长、敏感性差、阳性率低;作为金标准的组织病理学和深部组织培养由于其有创性而难于被患者接受,均己无法满足临床的需要。近年广泛应用的血清学方法以抗原检测为发展方向,对早期侵袭性念珠菌感染的诊断有一定价值,但是由于存在不可避免的假阳性和假阴性,限制了其在临床真菌检测中的应因此,如何提高念珠菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点,也是临床检验中要解决的关键问题。分子生物学技术的发展尤其是��际醯难该头⒄刮I畈空婢�腥镜脑缙谡锒洗丛炝颂跫�F渲惺凳庇ü舛�量��际醣苊饬舜�砅�以终产物检测定量产生的偏差,提高了实验的重复性。与常规��啾忍匾煨愿�浚�行Ы饩隽薖�产物污染问题,自动化程度高,敏感性通常达��奖矗痬��呶Э恚�馗葱院茫�壹觳馐奔涠蹋�粤俅�标本的要求降低,结果可靠直观,因此是一种非常有效的检测方法。目前,实时荧光��压惴河τ糜谌缫腋尾《竞徒岷烁司�炔≡�宓募觳夤ぷ鳎�诓≡�性真菌检测中的研究也有报道。将其应用于念珠菌感染的检测具有很好的临床意义和应用价值。本研究建立了对四种常见深部念珠菌�咨�钪榫�⒐饣�钪榫�⑷却��珠菌、克柔念珠菌�直鸹蛲�苯�屑觳獾牡ブ厥凳庇ü舛�縋�方法和多重实时荧光��椒ā�第一章单重实时荧光定量��椒ǖ慕�ⅲ涸贜��腉���中查找念珠菌属、曲霉菌属、毛霉菌属、隐球菌、人类的�����.���、����以及��、��蛐蛄小Mü鼵����砑�榷哉页霭咨�钪榫�⒐饣�钪�菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的特异性保守序列,选择变异较大且具有种属特异性的��序列用����软件分别设计针对上述四种常见中文摘要用。��������
从��������覥��从������������������念珠菌的特异性引物和探针,建立针对这四种念珠菌的单重实时荧光定量��方法。白色念珠菌:���覶����一�疨������’,扩增片段长度为��;光滑念珠菌:��痏�������覶��从��’,���┰銎�纬ざ任���;热带念珠菌:���覣���琍�����增片段长度为��:克柔念珠菌:���籄�������从���’,�一�’��覥�������’,������┰銎�纬ざ任猯首先对建立的���√逑到�杏呕��范ㄋ闹终婢�ブ厥凳庇ü舛�縋�体系各种成份的最适浓度,白色念珠菌:引物����逑担�秸���/体系,��酆厦���逑担琩�����/体系,�����逑担还�滑念珠菌:引物浓����逑担�秸�.����逑担琀������酆�酶�/体系,������/�系,�����逑担蝗却�钪榫�阂����/体系,探针����/体系,����/体系,�����.系;克柔念珠菌:引物����逑担�秸���/体系,��酆厦窱��逑担琩�����/��担琈���/体系。其次,在选定的荧光探针靶基因的上下游设计引物,用普通