免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题.ppt

免疫组化、免疫荧光、
流式细胞术的应用比较
及常见问题分析
宋砚明
song_yanming@
免疫组化(IHC)的应用介绍
免疫荧光(IF)的应用介绍
流式细胞术(FC)的应用介绍
IHC、IF、FC区别与联系
免疫组织化学原理及特点
利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术,通过化学反应使标记抗体显色,对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的一门技术。
免疫组化具有操作简单,特异性强,敏感性高,定位准确,形态与功能相结合等特点。
免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)
细
胞
抗原
一抗
二抗
辣根过氧化物酶(HRP)
3,3-二氨联苯胺(DAB)显色剂
棕褐色络合物
IHC反应原理示意图
组织切片/芯片制作
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的基础研究、临床研究、应用研究和新药开发等。
免疫组化染色(IHC);
原位杂交(ISH);
荧光原位杂交(FISH);
原位末端标记分析(TUNEL);
原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅助的cDNA杂交。
1. 组织芯片
组织芯片(或组织微阵列)是将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上,组织芯片中含有蛋白,RNA及DAN分子,是一种高通量的研究分析工具。研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的关系。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
全套鼠类器官组织切片;
全套猴类器官组织切片;
人类常见癌症组织切片;
组织芯片客户定制服务。
组织芯片/切片应用
免疫组化流程示意图
2. SP法
原理:根据生物素(Biotin) 与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗(兔源与鼠源)与相应的靶抗原结合后,生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合;二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素结合,形成抗原~特异性一抗~生物素化的二抗~HRP 标记的链霉亲和素复合物。
特点:该法孵育时间短(通常为10min),灵敏度高以及低背景染色等特点。
1. SABC法
原理:SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲和力这一生物学性质,先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合,形成生物素化HRP,然后与链酶亲和素按一定比例混合,形成SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合,再与SABC复合物联结形成抗原~抗体~生物素化二抗~ SABC复合物。最后用底物显色剂显色。
特点:该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点。
3. Polymer酶标二抗法
原理:该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链,将该多聚物与二抗结合,然后可再标记上多个HRP/AP酶分子,所以同样具有很高的信号放大作用。
特点:灵敏度高;操作步骤简单;无需进行内源性的生物素封闭。
IHC二抗原理及选择
4. 直接酶标二抗法
该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单,成本低,但是因为没有信号放大作用,所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到。
IHC常用酶标二抗原理示意图
2. AEC显色法
产品描述:3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole,AEC) 是过氧化物酶(Peroxidase) 的显色底物,在过氧化物酶的催化下,AEC显色工作液会于反应部位产生溶于酒精的红色沉淀,必须在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶(HRP)系统的免疫组化显色,包括AEC显色原和与之配套的稀释液。
试剂盒组成:
AEC显色原(试剂A)
AEC底物缓冲液(试剂B)
1. DAB显色法
产品描述:二氨基联苯胺( 3,3’-diaminobenzidine,DAB ) 是过氧化物酶(Peroxidase) 的显色底物,在过氧化物酶的催化下,DAB显色工作液会于反应部位产生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶(HRP)系统的免疫组化显色。
试剂盒组成:
DAB显色原(20×)(试剂A)
DAB底物缓冲液(1×)(试剂B)
3. BCIP/NBT显色法
产品描述:BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑)是一种冷藏稳定的、单一组分溶液,用于免疫组化、原位杂交、western blot、northern blot和southern blot,特异性地与碱性磷酸酶(AP)反应生成紫色物质。
试剂盒组成:
有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑
IHC显色方法原理及选择
4. BCIP/INT显色法
产品描述:BCI