(forcolordetectionwithDAB)DNA探针标记和检测试剂盒Ⅰ产品编号:MK1008保存期:一年-20℃冰冻保存。用途:用于DNA探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。工作量:—3μg的探针6次及1000张切片的原位杂交或12次10×10cm膜上杂交检测。原理所谓DNA探针,实质上是一段已知的基因片段,应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同,就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交,从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中,有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物,以单链DNA作为模板,在Klenow酶的作用下,合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后,再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测,就可以肯定杂交反应的存在。免疫检测采用过氧化物酶系统,DAB显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。试剂盒内容:(高效),25μl—MouseAnti——,5g特点:标记属高效标记反应。以1μgDNA探针为例,,20小时可产生2μg左右的标记探针。试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液,使用至为简便。标记反应适于下述对象:—3μg。—10kb。。。检测系统抗体为抗地高辛单抗+SABC。抗地高辛单抗标记生物素,效价1:1000-2000(膜上杂交)或1:1000(原位杂交)。显色剂为DAB,非常稳定。用时1:40稀释。,足够检测出1μg基因组DNA中的单个基因。除用于各种膜上杂交之外,还可用于原位杂交(ISH)。操作程序一随机引物标记操作程序如下:①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μgDNA至总体积16μl。②DNA热变性:把DNA瓶置于沸水中,水浴10分钟。然后,迅速地插入碎冰中3分钟以上。③加4μlDIGRandomLabelingMix(高效),混匀后再离心2000/×5分钟。④置37℃反应至少120分钟。时间越长,产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。⑤加入2μ110mMEDTA以中止反应,对于原位杂交和膜上杂交反应来说,标记反应可告结束,上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。可根据下表估计标记产量:DNA模板量标记一小时标记二十小时10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng二核酸探针膜上杂交原理和操作(一)杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成
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