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如何阅读质粒图谱
第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)
第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。
(1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。
(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。
(3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。
(4)neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活
(5)hygr 使潮霉素β失活。
第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于
外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标
志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的
基因。
第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外
源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转
化效率越低。
第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位
点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入
一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要
以实验目的为准绳。
启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
a 启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子
编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转
录的部位,但启动子本身不被转录。
b增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有
增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向
无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,
负调控序列。
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