谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定.doc

血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定原理谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要,其活力以催化GSH氧化的反应速度,及单位时间内GSH减少的量来表示,GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子,于423nm波长有最大吸收峰,测定该离子浓度,即可计算出GSH减少的量,由于GSH能进行非酶反应氧化,所以最后计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。试剂和仪器仪器:可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂:-.2mol/,用少量HCL、,4℃保存。1mmol/L谷胱甘肽(还原型GSH),临用前配制,冰冻保存1-2日。-%-,用双蒸水稀释至100mL,作为贮备液,4℃避光保存,临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。(先用蒸馏水溶解),用普通滤纸过滤,室温保存。:,室温保存。,4℃避光保存1个月。%生理盐水实验步骤样品制备溶血液:取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中,充分振摇,使之全部溶血1:100待测,4h内测定酶活力。若当天来不及测定,将肝素抗凝全血置-20℃冻存,3d内测定,若4℃存放,28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。组织上清液:动物禁食过夜,处死后,立即取出所需脏器,放入冷生理盐水中洗去浮血,剔除脂肪及结缔组织,滤纸吸干后,在冰浴上剪成碎块,称取适量组织,,以20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复3次制成5%组织匀浆,操作在冰浴中进行,匀浆以12500×g离心10min(低温高速离心机),以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体,上清液用以测胞液中的酶活力,最好当天测,否则加20%(v/v)甘油分装于塑料管,放置-20--80℃,可保存数周,而酶活力不减。GSH标准曲线的制作:、、、、、,分别置于10mL小容器瓶中,各加入偏磷酸沉淀剂8mL,用双蒸水稀释至10mL刻度,即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。取上述不同浓度标准液各2mL,放入试管中,,,5min内在可见光423nm波长测OD值,以双蒸水调零点。以GSH含量(μmol/L)为横坐标,OD423值为纵坐标,绘制标准曲线。测