肺腺癌实验动物造模.ppt

肺腺癌实验动物造模*;;:-A-1细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型;(ENU)腹腔注射BALB/c小鼠;-stop-loxK-rasG12D小鼠鼻腔吸入Ad-Cre重组腺病毒。*动物的选择:小鼠的肺癌在组织、形态、分子特点上与人类肺癌比较相近,且小鼠基因与人类基因的同源性在90%以上,基因容易操纵,所以小鼠肺癌模型在肺癌研究中应用广泛。但是人类肿瘤在小鼠体内生长很快,提示小鼠和人类对肿瘤的敏感性有显著差异,并且小鼠肺癌具有散发性和异源性的特点。因此,小鼠肺癌模型对原发性肺癌的研究价值不大,而多用于制备移植性肺癌模型,如在免疫缺陷小鼠体内进行同位或异位移植。*;;乙基亚硝脲(ENU,40mg/kg);A/J小鼠或BABL/;;SP-C/myc/IgEGF双转基因小鼠(寿命9个月),细支气管肺泡腺癌;SV40T抗原与p53蛋白和Rb蛋白结合,。;*方法一:采用人肺腺癌SPC-A-1细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型::裸小鼠(BALB/C-nu/nu裸鼠);4~5周龄,体重(16±2)g,SPF级,雌雄各半。:皮下注射细胞悬液;剂量:每只2×10^6SPC-A-1细胞数;部位:右前肢腋窝皮下;:平均成瘤时间为7d;28d后,瘤体平均长径为(±)mm;平均短径为(±)mm;平均瘤体体积为(±)mm3;平均瘤重为(±)g。*注意事项:(1)裸鼠年龄的选择。一般随着裸鼠年龄增大,裸鼠体内正常T细胞会增加,免疫功能相应增强,影响移植成功率,故一般选取4~5周龄的裸鼠为佳;(2)肿瘤细胞自身的生物学特性。SPC-A-1肺腺癌细胞株,因其分化程度低、恶性程度高、生长速度快等特点,故相对于一些手术切除的标本,其建模的成功率较高;(3)细胞状态的选择。一般选取处于对数生长期的细胞,细胞活力强;(4)接种部位的选择。一般在腋窝部皮下成功率较高,因为此部位血管丰富易使肿瘤成活,且方便肿瘤测量及观察;(5)穿刺进针的角度及深度。,进针过深肿瘤较难观察且易与深部肌肉组织粘连,过浅易致悬液漏出,导致肿瘤生长大小不均。*方法二::SPF级近交系BALB/c小鼠,鼠龄为4~5周。:妊娠的第17天;乙基亚硝脲(ENU)腹腔注射;剂量为40mg/kg体重;:子代鼠的鼠龄满32周时收获其全肺标本。:病理显示这些肿瘤为处于不同发展阶段的腺瘤和腺癌,腺癌的类型有细支气管肺泡癌样腺癌(雌性:5/6,雄性:4/6)和分化不等的腺癌(雌性:4/6,雄性:5/6),诱癌频率在雌、雄性小鼠均为5/6,癌变频率在雌性16/43,雄性12/31。*方法二造模特点(1)一次性给药,避开了多次给药的复杂过程;(2)动物耐受好,肺内肿瘤的生长基本不影响小鼠的生长,在长达32周的观察期间死亡小鼠的数量少;(3)所诱发的肺肿瘤自然演进,有利于动态观察;(4)由于肿瘤发生、发展的不同步性,在一给定的时间点可观察到处于各个发展阶段的肿瘤,有利于评估诱癌频率和肺肿瘤的癌变频率。(5)BALB/c是一个中等易感的品系,与上述几种品系的小鼠相比,B6、A/J和129等,随着鼠龄的增长可有自发的肺腺瘤或腺癌形成,在A/J小鼠肺肿瘤的发生频率可达100%。*方法三:病毒诱癌模型采用Lox-stop-loxK-rasG12D小鼠鼻腔吸入Ad-Cre重组腺病毒步骤:;-CreCaPi的共沉淀物滴入小鼠的鼻腔。制备方法:*10^7pfu的Ad-Cre50μl+69μl的MEM(培养基)+,隔5d后重复滴入,重复2次。诱导共30d。*方法三一般结果:Lox-stop-loxK-rasG12D小鼠在鼻腔吸入Ad-Cre:(1)7d后,细支气管出现肺支气管上皮增生;(2)20d后,细支气管出现肺支气管上皮非典型性增生;(3)30d后,不仅出现肺支气管非典型性上皮增生,而且旁边出现癌巢。*