引物设计Oligo6.doc

引物设计Oligo6.doc:..”打开〃快捷图标或者用快捷键1XTrl+O〃”打开"乳|Bd|苗|B|倒其|喇却么|HHBj文件名氓):1drosfr打卵)文件类型1NucleicAcidFiles(*.seq) ▼|取消JOpenas:(NucleicAcid 」”打开"FileChangeViewHelpOpen查挽范围(1):| FreqSeqdrosfr■Fj»f*4出现以下窗口,点击”window"再点击"Tile"•OLIGO-drosfr□回区1FileEditAnalyzeSearchSelectChangeView10s|ad|s|H|e|纠屬|e|纠权SSLDendrosfr-Frequenciesof6-風ers[]D^idrosfr-InternalStabilityDadrosfr-BeltingTemperature[21->er]□回®□,图中显示的三个指标分别为Tm、AG和Frq,,为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade排列方式不太方便,可从windows菜单改为tile方。如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,,只是显示更清楚了。AG值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的AG值在5'端和中间值比较髙,而在3'端相对低(如图:)Tm值曲线以选取72°C附近为佳,5'到3'的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为”Oligo6"新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时,宜选用3'端Frq值相对较低的片段。出现以下窗口,点OK就OK了。当然你也可以点击”Prameters〃和“SearchRange〃选择你要的参数和你上下游引物的位H及你扩增产物的长度,LIGO-drosfrEPFileEditAnalyzeSearchSelectChangeViewWindowHelpSearchforPri>ersandProbesdrosfr-畺elt✓+StrandSearciStrandSear«;---!CTGTTCTACGACAAGATG—AGdrosfr—Int••---- |~patiblewiththeLowerFCSequencingPrimer(hybridizationProDuplex"freeOligonucleolHighlySpecificOligos-ZEliminateFalsePrimingOligonucI「andContinueAboveSearchinOther |OligonucleotideswithinSelectedStabiHairpin-free01igonucle<ersIDefaultsISearchMode:MarkUnmarkrfl30;TATGTGTTCATATGATTT:,点”OK〃,#代表引物对的编号,依次为引物对所处的位置、产物的长度、,CR〃窗口,告知你扩増片断的位置,最合适的退火温度等等信息点击任一行出现”PCR"窗口,告知你扩増片断的位置,敁合适的退火温度等等信息。点击任一行出现”PCR"窗口,告知你扩増片断的位置,最合适的退火温度等等信息。关掉”PCR窗口〃和”primerPairs窗口〃回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置,图中手型鼠标所指即为引物序列。至此引物设计己经完成,你可以用”Analyse"菜单分析你的引物:有无引物二聚体、发卡结构等等。当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检査引物二聚体尤其是3'端二聚体形成的可能性。需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(crossdimer)。二聚体形成的能值越髙,越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较