RNAi实验原理与方法RNAi发现历程:1990年,曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因,希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了:矮牵牛花完全褪色,花瓣变成了白色!,应用正义链RNA作为对照,研究par-1基因的表达,意外的发现,正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。1998年,,观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNAinterference的概念。Acontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNAMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization2006年的诺贝尔生理学奖获得者:(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi)。RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)起始阶段:加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶,是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片段的3’端都有2个碱基突出。RNAi效应阶段:siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-plex,RISC)。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了,但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。RNAipathwaymiRNAandsiRNASiRNA在RNA沉寂通道中起中心作用,是对特定信使RNA(mRNA)进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子。MicroRNA(miRNA,微RNA)即为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中,不具有开放阅读框架,不编码蛋白质,一般长20-24nt。;,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点;;,所以其功能界限变得不清晰,如二者在介导沉默机制上有重叠;。miRNA与siRNA相同之处:,是生物体的固有因素;而siRNA是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是RNA干涉的中间产物。,miRNA是单链RNA,而siRNA是双链RNA。,miRNA是不对称加工,miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂,其他部分降解;而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。,miRNA主要作用于靶标基因3’-UTR区,而siRNA可作用于mRNA的任何部位。,miRNA可抑制靶标基因的翻译,也可以导致靶标基因降解,即在转录水平后和翻译水平起作用,而siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。,调节内源基因表达,而siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。miRNA与siRNA的不同点:
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