大肠杆菌质粒提取.doc

(离心柱型)使用前在漂洗液PW中加无水乙醇柱平衡:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入平衡液BL,12000rpm、离心1min,倒掉收集管中的废液,吸附柱放回收集管中。(使用当天处理过的柱子)取1-5ml过夜培养的菌液,12000rpm、离心1min(EP管收集3次)尽量吸除上清向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1(检查是否已加入RNaseA),涡旋彻底悬浮菌体沉淀(不要留有菌块,会影响裂解)。向离心管中加250μl溶液P2,温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解,室温放置3~5min(温和翻转,不要剧烈震荡。此时菌液变得清亮粘稠,时间应不超过5min,以免质粒受破坏)。向离心管中加350μl溶液P3,立即温和的上下翻转6~8次,充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。12000rpm、离心10min。(P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如有微小沉淀可再次离心后取上清)。(此时可做胶,以备检测用)取上清转移到吸附柱CP3中,不要吸出沉淀。12000rpm、离心1min,倒掉收集管中的废液,吸附柱放回收集管中。向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW(检查是否加入无水乙醇),12000rpm、离心1min,倒掉收集管中的废液,吸附柱放回收集管中。重复操作步骤7。将吸附柱CP3放回收集管中,12000rpm、离心2min,将吸附柱中残余漂洗液除去(可将吸附柱CP3开盖放置数分钟,以彻底晾干残余漂洗液)。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加100μlddH2O/EB,室温放置2min,12000rpm、离心2min,将质粒溶液收集到离心管中,-20℃保存。注意:使用前检查平衡液BL、溶