AO EB染色的讨论.doc

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色AO/EB原理与流程zhongyisheng:1原理:吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞,嵌入核DNA,发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强,荧光更为明亮,均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异,很易判别。在荧光显微镜下观察,可见四种细胞形态:活细胞(VN),核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞(VA),核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状;非凋亡的死亡细胞(NVN),核染色质着橘红色并呈正常结构;晚期凋亡细胞(NVA),核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。2AO/EB染色及观察结果:取20-100μl的1:100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min,PBS洗涤2-3遍,上覆盖玻片,荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。ym1051:?"1:100稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞?zhongyisheng:1用1mlEP管稀释时,先取微量的染色剂,然后再取稀释剂(如BSA)加入EP管吹打即可。2消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗?zhongyisheng:的确,不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然,由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌,在国际上比较通用,尤其是在进行动态检查时。医琳师妹:我将我所作的方法与大家共享:吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡(acridineorange/ethidiumbromide,AO/EB):1)细胞爬片:在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片,接种细胞悬液,干预后,予95%乙醇固定15分钟,微干,然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl(临用前混合加入,加样量宜小,有时各2μl-5μl足够,量太大容易形成细胞凋亡的假阳性),在照相前混匀后加入,轻轻吹打,30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。(,避光保存)计取5个视野,共100个细胞中凋亡细胞百分数。2)如制成细胞悬液:取100μlPBS稀释的细胞悬液,加2μl的染色液,其中AO/EB,各含100μg/ml,加入染料30秒后观察摄像。(有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)混合液,各含100μg/ml。细胞离心,悬液于PBS中,取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液,轻轻吹打,滴至载玻片上,加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。)fffwu:请问:请评价AO/EB法观察细胞凋亡的方法!哪里有相关图片!jmtang:尤其第一篇文献!1、Criticalevaluationoftechniquestodetectandmeasurecelldeath–elllineHL60MarinaLeiteA1,M