无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南.doc

无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南(omega)详细内容:®FastfilerEndo-freePlasmidMaxiprepProtocol(无内毒素质粒大抽提)1.   在1-4升的培养瓶中加入200-500mlLB培养基,然后加入菌种于37℃摇床培养12-16小时;Tip:为获得最好的结果,请接种1ml培养过夜的菌种(12-16hr)。(endA-)品系用于常规的质粒提取,如DH5a和JM109。注意:菌液的培养时间不能超过16小时;2.   收集200ml培养基至适当的离心管,室温下,3,500-5,000×g离心10分钟沉淀;3.   吸尽并去除培养基,用干净的吸水纸吸尽壁上多余的液体。,涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞;注:充分重悬细菌沉淀物对获得高产量的质粒是相当关键的。充分重悬后溶液是均匀的,不存在小块物质;请尽量吸弃残余的培养基以防止稀释加入的溶液;4.   ,轻轻颠倒旋转混匀7-10次至获得澄清的裂解液;室温放置3-5分钟可以有是必须的。避免剧烈振荡混匀而打断染色体DNA,降低质粒的纯度。(SolutionII使用后请盖紧盖子且于室温保存);5.   将取出LysateClearanceFilterSyrine活塞,将其放置于架子上;6.   加入12mlNeutralizationBuffer,轻轻颠倒混匀几次至出现絮状沉淀。这可能需要放置2-3分钟并间断颠倒混匀;7.   立即将裂解液转移到lysateClearanceFilterSyrine中,垂直放置5分钟。这时白色的絮状沉淀物会漂上溶液的上层,裂解液可能开始流出过滤器,用新的50ml管子收集细菌裂解液,并将活塞轻轻插入过滤器中;8.  握住过滤器,轻轻推动活塞将裂解液打到收集管中;注意不要将任何杂质打到收集管中;9.  (蓝色)到收集液中,轻轻颠倒旋转混匀7-10次,冰浴放置20分钟;注意:加入ERTSolution后,溶液应变得浑浊,但冰浴静置后溶液应是澄清的。10.  37℃孵育5分钟,溶液重新变为浑浊。室温下,3,000×g离心5分钟,ERTSolution(蓝色)分层于离心管底部。11.  把上面的水相(上清液)转移到新的50ml离心管中,加入1/3体积的GBTBuffer,轻轻颠倒旋转混匀1-2次。注意:转移上清液时不要吸到任何ETR溶液,因为其含有高浓度的内毒素;12.  平衡DNA柱子:用HiBindDNAMaxiColumn套在收集管中,加入10mlBufferGPS至HiBindDNAMaxi柱子中,室温下3000×g离心2分钟;去除滤过液并重复使用收集管;13.  加入23ml澄清的裂解液至DNA柱子中,3,000×g离心2分钟。去除滤过液并重新收集管;14.  将剩余的裂解液加到柱子上,按上述条件离心,去除滤过液并重新使用收集管;15.  加入10mlBufferHB至柱子中,3000×g离心2分钟,去除滤过液并重新使用收集管;16.  加入15mlDNAWashbuffer(已用乙醇稀释)至柱子中,3000×g离心2分钟,去除滤过液并重新使用收集管;17.  加入10mlDNAWashbuf