EMSA实验体会.doc

非放射性EMSAEMSA是一个比较复杂的试验技术,由于工作原因接触这个试验技术到现在也有三年多的时间了,做了大概也有几百次吧,那倒理想的试验结果的同时也碰到了很多莫名的问题和结果,到现在为止还有没有解决的,找不到原因的一个问题,呵呵!EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的!比如曾经在我们这个论坛中有站友提到这样一个问题:某公司的激活-和转运检测试剂盒,监测是否激活NF-KB测试剂盒原理:NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物,分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活NF-κB的刺激存在的情况下,IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化,随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-κB和IκB-α解聚后,其核定位序列被暴露,从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内,就可以判断NF--κB激活-核转运检测试剂盒仅染色p65,不染色RelB、C-Rel、p50和p52。使用本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光,(!):这种理论上来讲可行,但是实际操作可能拿不到你想要得结果,原因很简单,凭染色来判断是很难区分程度上的差异的,就比如做WB实验,经典的还是化学发光的方法,显色的方法只能得到信号比较强的蛋白,遇到信号比较弱的蛋白就误差很大了,第二点,并不是所有能进核的蛋白都有结合DNA的能力,如果结合了那才是真正的参与转录的转炉银子,有的入核后却不能和DNA结合,只能等着被降解!其实总体而言大家做试验时都希望成功,但是EMSA试验技术的独特性和复杂性决定了,要想做成功EMSA试验,拿到阳性结果可总结为一句话:把握整体,注意细节!我觉的EMSA的整体性包括6大点:探针制备(设计,合成,标记,纯化,退火);个人实验设计(时间剃度浓度查阅文献等);核蛋白制备;浓度测定;EMSA操作;!中间就必须注意到这六大点的细节,包括操作细节,在这点上,我倒是很佩服美国佬的态度,,并养成一个实验习惯;比如其中的一点:他们培训我们在配置溶液的时候只要是液体的东西无论什么养成一个习惯就是摇一摇,因为有些溶液静止时间长了有效的大颗粒可能下沉,要是直接取会造成不均匀的误差,到时候试验结果出了问题,很难推断操作错误的地方,养成一个习惯即使是蒸馏水也摇一摇,呵呵,倒不是说的这么夸张,但强调的是一个严格而良好的试验习惯!呵呵,言归正传,实验技术毕竟是一门动手性很强的科学,理论还是和动手还是有一定差别的,,以便站友学习,另外,,只能等大家遇到问题,只要我有时间在线就尽力帮忙交流,呵呵!我做的最多的还是NFKB,此外还有AP-1,STAT3,STAT5,HIF等,:EMSA(ElectrophoreticMobilityShi