总DNA的提取.doc

、蛋白质等杂质都将会影响以下实验步骤,而过多的纯化的步骤又会造成DNA的大量损失和DNA片段的破碎。土壤总DNA的质量直接决定实验着是否能够准确的反应微生物的实际群落组成结构,实验证明不同提取方法获得的DNA,经DGGE分析会产生不同的群落结构指纹图谱Error!Referencesourcenotfound.,因此选用合适的DNA提取方法是十分重要的;,所以必须在在DNA的质量和纯度上做出最佳的平衡选择,Krsek和WelingtonError!+溶菌酶+SDS的组合可从土壤中获较高产量和纯度的DNA。直接提取法参照Krsek和WelingtonError!,具体使用试剂和步骤方法如下:实验试剂:DNA提取液(1%(W/V)CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)、100mM磷酸钠、100mMTris-HCl、100mMEDTA、PH=8);20mg/ml蛋白酶K;50mg/ml溶菌酶;10%SDS;饱和酚;酚/氯仿/异戊醇(25:24:1V/+V);氯仿;100%乙醇;70%乙醇;异丙醇。提取步骤:,然后加入1mL提取缓冲液混匀,在细胞裂解过程中将所提取样品于液氮和65℃水浴中反复冻融2次;(终浓度5mg/ml)和蛋白酶K(),并加入终浓度为1%的SDS混合均匀,在65℃水浴中放置60min,期间每20min颠倒混匀一次,12,000rpm离心20min,小心的将上清液转移到另一个干净的EP管中;,上下颠倒EP管混匀,12,000rpm离心10分钟,将上清液转入另一洁净的EP管中;,上下颠倒EP管混匀,12,000rpm离心10min,将上清液转入另一洁净的EP管中;,上下颠倒EP管混匀,并在-20℃放置1小时,12,000rpm室温离心15min;,使用75%乙醇洗涤沉淀两次,在室温下自然干燥,用50μl灭菌双蒸水或TE缓冲液重悬DNA沉淀,充分溶解后放入-80℃冰箱保存。试剂盒提取方法和步骤参照说明书进行,所提取DNA放入-80℃冰箱保存。,根据凝胶浓度、电泳时间和电压大小的不同,-60Kb之间的DNA片段。实验试剂:琼脂糖;1×TAE电泳缓冲液(TAE:-醋酸,);EB(Ethidiumbromide,溴化乙锭)溶液或GeneFinderTM染料(Bio-V公司)等核酸染料。实验步骤:-(视实验所需分离DNA片段大小而定)加入到三角瓶中,加入100ml1×TAE溶液,于微波炉中加热,稍待冷却后,倒入已插上样品梳的凝胶槽中;,小心拔出梳子,将凝胶连同凝胶槽一同放入已校准水平的电泳槽中,电泳槽中加入1×TAE电泳液缓冲液,;,设定电压和电泳时间(视实验所需分离DNA片段大小和凝胶大小而定);表2-1凝胶浓度与DNA片段大小的关系Table2-1ThegelconcentrationusedforvariouslengthofDNAfragment琼脂糖凝胶浓度(%)线性DNA分子的有效分离范围(kb)------(视DNA片段大小而定),关闭电源,将凝胶放入染色液中染色(如使用EB,操作时应带乳胶手套操作),在紫外成像仪上成像并拍照。,直接进行PCR扩增效果较差,因此对DNA样品进行纯化处理,本试验纯化采用琼脂糖割胶回收或电洗脱法对DNA进行纯化,电洗脱法适用于回收大于5Kb的片段效果较好。电洗脱法纯化步骤::选取长为10~20cm的透析袋,将透析袋在1mMEDTA()、2%(w/v)NaHCO3溶液中煮沸10分钟,取出透析袋用蒸馏水彻底冲洗,在1mMEDTA溶液中()煮沸10分钟,让透析袋自然冷却,4℃贮存(贮存期间,要始终让透析袋浸入溶液之中);使用前,用蒸馏水充分冲洗袋的内外壁(操作时要带手套);,确定目标片段的位置,使用手术