鳜过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及表达.pdf

学位论文独创性声明
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献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

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签字日期: 年月日签字日期: 年月日
论文题目鳜过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及表达
姓名宁瑞红学号 405611511067 论文级别博士□硕士□
院/系/所生命科学与食品工程专业生态学
联系电话 ********** E_mail guochina2005@
通信地址(邮编):江西省南昌市红谷滩新区学府大道 999 号
备注:

□公开□保密(向校学位办申请获批准为“保密”, 年月后公开)
I
万方数据
摘要
摘要
鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要的名贵淡水经济鱼类。近年来,鳜常受到
细菌、病毒等病害的影响,对鳜的养殖业发展产生了极大的影响,造成严重的经
济损失。本文采用 RACE-PCR 的方法克隆了鳜两个重要的抗氧化酶—CAT 和 GPX
的 cDNA 序列全长,分析了 CAT 和 GPX mRNA 在鳜组织内的表达;另外,对 CAT
基因进行了原核表达。
1. 鳜 CAT cDNA 全长为 2216bp,包括编码区 1581bp,3’端非翻译区 635bp,
含有典型的腺苷酸信号序列 AATAAA 和 PolyA 尾。该基因序列开放阅读框(ORF)
编码 527 个氨基酸,预测蛋白质分子量为 kDa,等电点为 。BLAST 分析
显示鳜 CAT 氨基酸序列和其它物种 CAT 基因有很高的同源性。氨基酸序列分析
发现鳜 CAT 存在高度保守的过氧化氢酶近端血红素配体签名序列
(354RLFSYPDTH362) 和过氧化氢酶近端活性位点
(64FDRERIPERVVHAKGAG80)以及 3 个催化位点残基“ H”、“ N”和“ Y”。另外,
还有三个糖基化位点(148 NNTP 151)、(439NFTQ442)和(507 NTTV510),12 个
NADPH 结合位点和过氧化物酶体靶信号 SKM。系统发育树结果表明鳜与条石鲷
的亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR 检测鳜 CAT 的 mRNA 在组织中表达情况,
结果显示鳜 CAT 的 mRNA 在 9 种组织中均有表达,其中在肝脏表达量较高。最
后,构建了 ScCAT+pET-30a 重组质粒并热激转入大肠杆菌 BL21(DE3)中,成功地
诱导出了 ScCAT 的天然可溶性重组蛋白,可用于后续重组蛋白的纯化、分析及抗
体生产。
2. 谷胱甘肽过氧化物酶是生物体机体抗氧化防御系统主要的酶类之一。鳜
GPX 基因 cDNA 序列全长为 948 bp,开放阅读框 564 bp,3′非编码区 384 bp,
密码子 TGA 编码 1 个硒半胱氨酸( Sec),不是终止密码子;3′非编码区形成 1
个硒半胱氨酸插入序列(SECIS 元件)。鳜 GPX 氨基酸序列的硒半胱氨酸插入序
列元件属于 form1,与其它鱼类相比具有较高的同源性。氨基酸结构分析显示,
鳜 GPX 有 Sec 催化位点 Gln71 和 Trp148、稳定酶三级结构的 3 个环、PGGG 结
构域和由 Sec、Trp、Gln 与 Asn 构成的催化四联体。鳜 GPX 与脊椎动物 GPX1
和 GPX2 氨基酸序列同源性为 66%-91%。系统进化分析显示,GPX 聚为 3 大支,
GPX1、GPX2 和 GPX3 聚为一支