蛋白质一级结构(共价结构).doc

蕿莇蚃蛋白质的一级结构(共价结构)肅羁蒈蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。蚇袆肆蛋白质结构层次薁羂袅一级结构(氨基酸顺序、共价结构、主链结构)肀芆肄↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序芁螀膀二级结构膈蚅腿↓肂袁袅超二级结构芇肄膁↓螂羂羂构象(高级结构)结构域虿薄袈↓薃蚀羅三级结构(球状结构)螇芇薂↓芃螁荿四级结构(多亚基聚集体)。蒆袆羁拆分蛋白质分子中的多肽链。羂蒀蝿测定多肽链的氨基酸组成。蝿莅羆断裂链内二硫键。蚂薂蒄分析多肽链的N末端和C末端。袇螅莂多肽链部分裂解成肽段。蒃艿蒁测定各个肽段的氨基酸顺序艿膄聿确定肽段在多肽链中的顺序。膃莀蒄确定多肽链中二硫键的位置。莈袈螃蛋白质测序的基本策略羃蒂衿对于一个纯蛋白质,理想方法是从N端直接测至C端,但目前只能测60个N端氨基酸。蒆芇螈直接法(测蛋白质的序列)蚄艿薄两种以上特异性裂解法衿螆膄NC莄芀薁A法裂解A1A2A3A4羇膆薇B法裂解B1B2B3B4膅莂蚄荿薅芁用两种不同的裂解方法,产生两组切点不同的肽段,分离纯化每一个肽段,分离测定两个肽段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链。袅腿肈间接法(测核酸序列推断氨基酸序列)蒈羄莅核酸测序,一次可测600-800bp莁膁螄测序前的准备工作薆蒄蚁蛋白质的纯度鉴定膂节螀纯度要求,97%以上,且均一,纯度鉴定方法。(两种以上才可靠)羈膇莈⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带袂聿袄⑵DNS—cl(二甲氨基萘磺酰氯)法测N端氨基酸肇薇肂测定分子量薂膁芈用于估算氨基酸残基n=葿羆膇莃膂羄方法:凝胶过滤法、沉降系数法薈莅蒃确定亚基种类及数目肃罿羀多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式:羀袅袆⑴非共价键结合袄肁肃8mol/L尿素,SDSSDS-PAGE测分子量肈芄袄⑵二硫键结合薄肂莈过甲酸氧化:膇羇罿—S—S—+HCOOOH→SO3H莄袀肃β巯基乙醇还原:蕿莇肁肅羁膀举例::血红蛋白(α2β2)蚇袆蚈(注意,人的血红蛋白α和β的N端相同。)薁羂膃分子量:M肀芆蒂拆亚基:M1、M2两条带芁螀袂拆二硫键:M1、M2两条带膈蚅蒇分子量关系:M=2M1+2M2肂袁芃测定氨基酸组成芇肄袃主要是酸水解,同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。,便于选择裂解方法及试剂。虿薄芆①Trp测定薃蚀莃对二甲基氨基苯甲醛590nm。螇芇芄②Cys测定芃螁羁5、5/一二硫代双(—2—硝基苯甲酸)DTNB,412nm肀蚆艿端基分析羃蕿蒃①N端分析芈肆莀DNS-cl法:最常用,黄色荧光,灵敏度极高,DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。螄蚀葿DNFB法:Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯)抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等莆蒅肇PITC法:Edman法,逐步切下。无色PTH-氨基酸,有机溶剂抽提,层析。蒄蚁薃②-A-B-C-D-COOH无水肼NH2NH2100℃5-10h。袇莄袆羅薀袇A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH膀肇膂氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。(Pro不能测)芈蒇衿羧肽酶A:除Pro、Arg、:只水解Arg、Lys蒆袆薃NH2N……………Val—Ser—GlyC羂蒀莁蝿莅蚈图P118羧肽酶法测C末端蚂薂肆袇螅羄肽链的部分裂解和肽段的分离纯化蒃艿蝿化学裂解法艿膄莇①溴化氰—Met—X—产率85%膃莀膆②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%莈袈膁③NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸)—X—Cys—羃蒂薁④羟胺NH2OH—Asn—Gly—蒆芇膆约150个氨基酸出现一次蚄艿芆酶法裂解衿螆薂①胰蛋白酶LysX莄芀羈(X≠Pro)羇膆腿Arg——X膅莂芆荿薅羃袅腿蚀②胰凝乳蛋白酶Tyr——X蒈羄羇(X≠Pro)莁膁莆Trp——X薆芆莃羄肄膈Phe——X螁罿螆蚄袁蒆胃蛋白酶