hoechstpi染色.doc

2008/11/0909:55PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集。故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞。电子天平准确称取1mg碘化丙啶(propidiumiodide,PI)溶于10mlPBS(),成100ug/ml的储备液,用前等量混合(注意避光)protocol:1、收集细胞,数量需1-2×10E6个(悬浮细胞直接吹起即可,对于贴壁细胞用胰酶消化时,最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子,防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析),离心,11,000rpm,5min。2、用1ml冰冷的PBS重悬后,离心:11,000rpm,5min。3、用200μl冰冷的PBS重悬后,用加样器混匀后,缓慢的加入含有4ml冰冷的70%乙醇的10ml离心管中,边加边摇匀。-20℃,过夜。(或者置4℃,1h后进行下一步)4、1,500rpm,10min,小心弃上清后,用1ml冰冷的PBS重悬,1,500rpm,5min。小心弃上清。5、加入含有40μg/ml的PI,100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl,37℃,培养30min-1h。混匀。溶液配方:PBS910μlPI80μlRNase10μl共1ml6、过滤,供流式检测。Hoechst33342/PI双染色法紫外光激发,Hoechst-PI双染在荧光显微镜下可见4种细胞形态:活细胞(VN),染成蓝色,核呈正常结构;早期凋亡细胞(VA),染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞(NVA),也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。非凋亡的死亡细胞(NVN),染成红色,核呈正常结构;贴壁细胞:1、培养细胞中加入hoechst染液,终浓度5μg/ml;2、37℃,避光染色10min,3、继续加入的PI染液,终浓度15μg/ml,4、4℃,避光反应10min,5、荧光显微镜下观察,照相。悬浮细胞:,终浓度为1μg/ml;%%胰蛋白酶消化成单细胞悬液,离心,弃上清,用1ml全培养液重悬细胞,加入Heochst33342,终浓度为1μg/ml,37℃孵育7~10min。℃500~1000r/min离心弃去染液。,4℃避光染色15min。。。另外这是活细胞染色,还有固定后染色的:细胞处理完毕用甲醇:冰醋酸(3:1)在4度固定5min后,PBS漂洗,进行以上操作。先染色后固定:,细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。℃固定5min。,点加Hoechst33258染色液,10min。,用滤纸沾去多余液体。。,终浓度为10μg/ml37℃孵育30min。%的多聚甲醛和培养液以1:3混合,使多聚甲醛的浓度为1%,固定细胞5~10min。,将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。,阻断滤片为400~500nm。以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法,也可先固定后染色:(~)×106个细胞,500~1000r/min,离心5min去上清。,500~1000r/min,离心5min去PBS。%多聚甲醛50μl重悬细胞,室温下固定10min。,500~1000r/min离心5min去PBS。,终浓度为16μg/ml,孵育15min。,荧光显微镜下观察,可数500个细胞,计算调亡率。注意事项:1、-20度70%乙醇固定细胞过夜,固定后可以放在-20度冰箱,一般能保存几个月;2、染色前要用DNA抽提缓冲液(PCbuffer)作用5分钟,;3、加PI的量按照1×PI,106个细胞5ul;4、加RNAase是为了消化RNA,以免影响DNA分析的结果。操作过程,不用一定强调无菌,但是干净点没错的。一般来说都采用用Hoechest-PI双染,正常细胞对染料