肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告.doc

袇薅蚅蒂莆生物化学实验报告芅蒃薀羀肆姓名:薄袂学号:葿螆专业年级:莁肁组别:衿薇蒃腿生物化学与分子生物学实验教学中心芈实验名称芇肝糖原的提取、鉴定与定量蒄实验日期蒂螇实验地点肇芁合作者薀膇指导老师螈莃评分羂XX袀教师签名芄李某某莄批改日期肁2013-06-03艿格式要求:正文请统一用:小四号,宋体,;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:四号,黑体,加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。羄实验目的膂1、掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 腿2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 虿3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。螅4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 芃5、正确掌握溶液转移的操作。 薁6、正确操作使用分光光度计。膈实验原理蒅1、肝糖原的提取与鉴定芄糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。蚀糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。  薈CuSO4十2NaOH = Na2SO4+Cu(OH)2↓  芅2Cu(OH)2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O  肂2CuOH = Cu2O↓(红色)+H2O  肂Cu(OH)2= CuO↓(黑色)+H2O羇2、肝糖原定量测定羆糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先臵于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。膃三、材料与方法:以流程图示意膁1、材料:蚀(1)样品:鸡肝螆(2)试剂:95%乙醇、5%(W/V)三氯乙酸、浓盐酸、(50%)NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、(30%)KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)、蒽酮显色剂芄(3)仪器和器材:普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管(2ml、5ml)、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板艿2、方法:肀(1)肝糖原的提取与鉴定蒇袄混匀蒄糖原水解液莁呈色对比罿+50%NaOH5滴袅+浓HCL5滴薂沸水浴15min,冷却螁加碘试剂2滴螀加碘试剂2滴羇糖原溶液2滴羄沸水浴2min,溶解沉淀膀沉淀(弃去)蒀鸡肝约1g,剪碎螄+l3COOH1ml肃研磨至乳状蕿+l3COOH3ml羆螆研磨成肝匀浆膁全部转入离心管中,离心3min(4000r/min)聿上清液(取2ml)蚇离心5min(4000r/min)袇+2ml95%乙醇,混匀,静置10min薃沉淀螂上清液(弃去)蒇白瓷板孔穴中蚄糖原溶液1ml蚂糖原水解液2滴膁+班氏试剂4滴膇沸水浴2min,观察变化蚆(2)肝糖原定量测定肄薁羈+30%(用吸量管)螇在分光光度计620mm波长处,用空白管溶液调零,测定并记录各管溶液的吸光度(A)膂沸水浴10min,,,,仔细混匀,获得糖原提取液薄冷却,,分别标记为空白管、标准管、%,混匀蚃四、结果与讨论:①结果:实验数据、现象、图谱;②讨论:以结果为基础的逻辑推论,并得出结论。衿1、结果:腿(1)实验现象:蚇1)肝糖原的提取与鉴定螂第一次离心后,肝匀浆分为2层,上层为上清液,不完全澄清,下层为淡褐色沉淀。薂罿图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后蒅‚加入乙醇混匀并静置后,溶液分层,上层为上清液,下层有白色絮状沉淀。膄ƒ第二次离心后,溶液分为2层,上层为上清液,试管底部有少量白色沉淀。羂蚀图3第二次离心后的白色沉淀薆④加入蒸馏水并沸水浴后,白色沉淀溶解。节⑤白瓷板上,糖原溶液加碘试剂后呈红棕色,与碘自身的黄色有明显区别。