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RT-PCR常见问题分析一、RT-PCR反应原理与方法RT-PCR是将RNA反转录(RT)和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因的表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。1RT-PCR反应步骤:第一,RNA提纯;第二,RT逆转录;第三,PCR聚合酶反应2RT-:即反转录和PCR扩增在同一管内完成,有助于减少污染,:即反转录和PCR扩增分两步进行,首先从RNA模板反转录得到cDNA,得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。:一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏,操作简便,污染率低,RNA二级结构减少,并且因为聚合酶有校正活性,从而降低了PCR反应的错配率。而在两步法中,两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性,同时可由一次反转录样品获得多个遗传信息,并且由于在第一步中将RNA反转录为cDNA,从而更易于保存。另外,两步法的整个过程比一步法更节省费用。3提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性:,无DNA污染。。,可以在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。,导致扩增效果不好,可提高逆转录反应温度。,避免在引物3´端含有互补序列,避免可以形成内部发卡结构的序列。RT-PCR常见问题问题一:RT-;提取RNA材料要尽量新鲜,防止RNA降解。RNA提取后,应储存在100%甲酰胺中,如果使用RNase抑制剂,加热时<45℃;pH<,否则抑制剂会释放所有结合的RNase。而且,在≥,一定要存在DTT。。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元()以帮助小量样品RNA的恢复;逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐;将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂;