非洲猪瘟病毒蛋白p54原核真核表达、间接ELISA检测方法建立及单克隆抗体制备.pdf

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暨南大学硕士学位论文


摘要
目的:利用 PET 原核表达系统和 pFastBac / NT-TOPO 真核表达系统分别表
达出非洲猪瘟病毒蛋白 p54,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接 ELISA 方法。同
时制备 p54 的单克隆抗体。
方法:将非洲猪瘟病毒蛋白 p54 的基因克隆到原核表达载体
pET-52b(+)3C/LIC 上,再转入大肠杆菌 BL21(ED3)中,获得重组表达蛋白 p54。
超声破碎菌体,取离心后上清进行 SDS PAGE 和 Western blot 分析。优化诱导表
达条件,利用表达蛋白上的六组氨酸标签进行蛋白纯化,获得高纯度的 p54。将
纯化后的 p54 包被酶标板,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接 ELISA 方法。
将非洲猪瘟病毒蛋白 p54 基因克隆到真核载体 pFast/NT-TOPO 上,转入大
肠杆菌 DH 5α中,扩大培养后涂布抗生素筛选平板,挑取生长的单克隆菌落获
得重组质粒,经 PCR 鉴定正确后,转入大肠杆菌 DH10 Bac 中,获得重组杆状
病毒质粒。利用脂质体介导,获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染 sf9 细胞,
72 h 后收集细胞,超声破碎,取离心后上清进行 SDS-PAGE 和 Western-blot 分析。
用上清包被酶标板,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接 ELISA 方法。
用原核表达的 p54 免疫小鼠,用真核表达的 p54 进行杂交瘤细胞筛选,采用
传统化学融合和有限稀释法制备出 p54 的单克隆细胞株。
结果:真核、原核表达系统均表达出非洲猪瘟病毒蛋白 p54,经 Western-blot
分析,重组蛋白可以和标准阳性血清反应,有良好反应性。基于原核/真核表达
p54 的间接 ELISA 方法,可以分别检测出 1:1280 和 1:320 倍稀释的标准阳性血
清。批内、批间变异系数分别小于 10%和 15%。检测 96 份血清样品与商品化试
剂盒的符合率分别为 %和 %。检测的灵敏性均为 100%。特异性分别为
%和 %。融合细胞经筛选后获得阳性克隆株,并制备出 p54 的单抗。
结论:成功建立了检测非洲猪瘟血清抗体的间接 ELISA 方法,建立的方法
具有灵敏、特异、稳定,操作简便的特点,同时制备了 p54 的单克隆抗体,为非
洲猪瘟病原的检测做好了技术储备。
关键词:非洲猪瘟病毒,蛋白 p54,间接 ELISA,单克隆抗体
I
暨南大学硕士学位论文

Abstract
Objective: PET prokaryotic expression system and pFastBac / NT-TOPO
eukaryotic expression system were used to obtain African swine fever virus protein
p54. Further more, indirect ELISA to detect antibody of African swine fever in serum
was established. At the same time, p54 monoclonal antibody was prepared.
Methods: Gene of p54 was cloned into pET-52b(+)3C/LIC vector, and then
transform into BL21(ED3) to get binan