毕赤酵母的摇瓶发酵方法.doc

摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段,1、酵母菌株生长阶段;2、脂肪酶诱导表达阶段。酵母生长阶段。准备试剂:1000mlBMGY培养基,1000mlBMMY培养基,10X的甲醇,摇瓶1L(灭菌),温控摇床,50ml离心管(灭菌)。紫外分光光度计,石英比色皿。以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基,然后加入约1ml脂肪酶菌株(培养基:菌液=100:1),用透气膜封口(透气,但是细菌不能透过)。置于温控摇床上,温度调至300C,转速为250-300rpm/min,使酵母生长,OD600=-,时间约为15-24小时。将发酵液转入50ml离心管,1500g-3000g离心5min。去掉上清,用BMMY培养基将菌体浓度稀释至OD600=,约有500ml左右。将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中,每个摇瓶150ml发酵液(绝不能超过200ml)。将摇瓶置于温控摇床上,温度调至300C,转速为250-300rpm/min,使酵母表达脂肪酶,每24小时加入一次5%的甲醇,%。连续诱导表达48小时。将发酵液进行12000rpm/min离心5min,取上清(若上清仍混浊,可反复离心);进行酶活分析和蛋白含量分析。BMGY培养基的配制(1000ml):20g蛋白胨(peptone),10g酵母提取物(YeastExtract),加水至700ml;1210C高温灭菌20min。然后分别在无菌条件下加入10XYNB100ml,10X磷酸钾缓冲液()100ml,10X甘油100ml。BMMY培养基的配制方法(1000ml):20g蛋白胨(peptone),10g酵母提取物,加水至700ml;1210C高温灭菌20min。然后分别在无菌条件下加入10XYNB100ml,10X磷酸钾缓冲液()100ml,10X甲醇100ml。10X的甲醇的配制:取甲醇(AR上海医药集团有限公司)5ml,加入无菌水95ml,配置成5%的甲醇溶液,(millipore公司)过滤除菌,该溶液在常温下的保质期为两个月。10X的YNB配制方法(1000ml):称取YNB(生化试剂,上海生物工程公司,不含硫酸铵)34g,加入100g硫酸铵,待完全溶解后,(millipore公司)过滤除菌。该溶液在常温下的保质期可以达1年。10X的磷酸缓冲液的配制方法:分别配制1M的K2HPO4和KH2PO4,然后将132ml的K2HPO4和868ml的KH2PO4混合,;调PH用磷酸或者KOH,然后1210C高温灭菌20min。该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。10X的甘油的配制方法(1000ml):取100ml的甘油加水至1000ml,然后1210C高温灭菌20min。该溶液在常温下的保质期可以达1年以上。:在下是初学者,关于毕赤酵母的诱导表达有些问题:+E*v1H  }0A$F3s+X    “每24h向培养基中添加100%~%”这里的甲醇浓度如何控制?4_/z"L!e:j/F4n:}    还有,%,%,应该是哪个?“每24h向培养基中添加10