增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp）在莱茵衣藻中表达的研究.pdf

增强型绿色荧光蛋白基因(e-gfp)
在莱茵衣藻中表达的研究

(生命科学学院,生物工程系生物技术专业吴锦霞)
(学号:2000302055)

内容提要:通过构建增强型绿色荧光蛋白基因(e-gfp)衣藻表达载体,利用“珠磨法”
将 e-gfp -849)中,经 Zeocin 抗性筛选出转 e-gfp 基因衣藻;
在光照下培养转基因藻,经 PCR 和 RT-PCR 对转基因藻进行分子检测,结果表明 e-gfp 已经
稳定整合到莱茵衣藻基因组中,并具有转录活性;随后的转基因藻相对荧光强度分析表明转
e-gfp 衣藻的相对荧光强度明显高于野生型衣藻。
关键词:衣藻;e-gfp 基因;
教师点评:该文通过对外源基因(e-gfp)在衣藻中的表达研究,构建了一个可用于外
源基因在莱茵衣藻中表达的体系。设计思路清晰,并得到了较好的实验结果。通过本文的研
究,掌握了分子生物学的基本实验技术,是一篇具有较高水平的本科毕业论文。(点评教师:
胡章立)

引言
莱茵衣藻是单细胞真核绿藻,有两条鞭毛能游动,能进行光合作用。因其具有生长周期
短,生长迅速,光合效率高而被称为“光合酵母”,而且它是少数三套基因组都能进行遗传
转化的植物。长期以来人们都在探索在衣藻里表达感兴趣的基因,随着基因枪技术的出现,
在衣藻叶绿体里表达外源基因的技术已经日趋成熟;但是,外源基因在衣藻核基因组中较难
获得稳定有效的表达。许多外源基因导入衣藻基因组后,会出现“基因沉默”问题,或是在
基因水平或是在蛋白水平受到阻遏。而对于导入基因不表达现象可能的解释有以下几点:1、
甲基化修饰;2、密码子偏爱;3、缺少内含子或其他非编码区;4、采用了异源的启动子和
终止子;5、异常基因降解;6、伴随分离;7、外界因素影响等,有鉴于此,所以我们需要
构建一个能使外源基因在衣藻中高效稳定表达的载体。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因是一个新的标记基因,来源于多管
水母属的 Aequorea victoria,编码 238 个氨基酸残基,分子量为 2688Da。经蓝光或紫外激发
而发射绿色荧光。其吸收波长为 460nm,发射波长为 509nm。GFP 的生色基团是由位于 65
-67 位的 Ser、Tyr 和 Gly 被修饰后共价连接而形成的。而增强型绿色荧光蛋白基因(e-gfp)
是在 GFP 的基础上,第 64 位氨基 Phe 被替换成 Leu,第 65 位氨基 Ser 被替换位 Thr,在保
留 gfp 基因原有特点的基础上,其荧光强度为 gfp 的 4~35 倍,因此,我们选用 e-gfp 基因
作为报告基因。
与其它常用的报告基因或报告分子相比, GFP 具有许多优点:① GFP的荧光易于检
测。用手提式长波长紫外灯、荧光解剖镜或荧光显微镜都可检测到足量表达的 GFP。②用
GFP 可进行活体检测,尤其对透明体可进行反复观测。③GFP 的构象非常稳定,不易发生
光漂白(photo bleaching),这有利于荧光激活的细胞筛选。④GFP 是合适的蛋白标签。由于
GFP 的分于量小(只有 54KD),可以将 GFP 基因和目标基因构建在一起表达融合蛋白