三体综合征产前诊断.ppt

21三体综合征产前诊断案例张某,女,31岁,商场收银员,怀孕15周,担心所孕胎儿不正常,前来进行遗传咨询。经询问得知,张某的一表姐曾生育一智力低下儿子,经某医院诊断为先天愚型,但具体核型不详。张某孕前检查各项优生指标均正常,孕前无感冒服药史,无有毒有害物质接触史。张某的丈夫,32岁,司机,有烟酒嗜好,在妻子怀孕前半年已戒酒,减少吸烟量。两人核型检查均正常,家族中其他特殊疾病患者。根据张某的情况,作中孕期唐氏筛查,结果张某血清的AFP,hCG和uE3检查结果阳性,再进行B超检查胎儿情况,证实胎儿胎龄正确,发育正常。根据上述资料,张某所孕胎儿具有21三体综合症的高风险,建议进行产前诊断。孕妇就诊常规筛查综合分析风险值孕期检查进一步确诊羊膜穿刺母亲年龄(>35岁)是影响发病率的重要因素。研究发现:年龄 20岁 25岁 30岁 35岁 38岁 40岁 42岁 45岁风险1/1400 1/1100 1/1000 1/350 1/175 1/100 1/65 1/25表6-2母亲孕龄与Down综合征发病率的关系母亲孕龄与Down综合征发病率的关系其发病率随母亲年龄增高而增高新生儿出生时母亲年龄Down综合征的发病率其他主要染色体异常的发生率201/14201/500251/12501/480301/11401/420351/3601/190401/1001/77411/801/55421/601/43431/481/34441/381/27451/301/20荧光原位杂交技术PCR技术结果分析遗传建议羊膜穿刺离心实验流程:羊膜穿刺---羊水中有一定数量胎儿脱落细胞(多为成纤维细胞和上皮细胞),经体外培养后,、染色体检查和提取DNA作基因分析,也可不经培养,用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取DNA作基因诊断。时间:妊娠16~20周步骤:(B超监视下进行)孕妇排空膀胱—腰穿针穿刺—穿过腹壁和子宫 壁进入羊膜腔—抽取羊水材料   仪器 离心机,水浴锅,恒温培养箱,荧光显微镜。试剂 荧光探针。工作液的配制:(1)20×SSC:氯化钠175g,,加三蒸水到1000ml。(2)变性液:甲酰胺28ml,20×SSC 4ml,蒸馏水8ml,终体积40ml,充分混匀,~,密封保 存于4℃~8℃,每次使用前均需测定pH值。(3)洗脱液:甲酰胺 20ml,20×SSC4ml,蒸馏水16ml,终体积40ml。(4)SSCT: 20×SSC100ml,Tween-,加二蒸水至终体积为1000ml。 抽取羊水5~6ml,1500rpm离心10min,去上清,留羊水细胞沉淀;%trypsin(溶于无CaCl2的Hanks液),37℃消化30min;2000rpm离心10min,去上清,在沉淀中加入4~,37℃孵育30min,再加入1ml固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1),轻轻混匀,2000rpm离心10min,去上清,加5ml固定液,轻轻混匀,2000rpm离心10min,去上清,加适量固定液,滴片。  、洗脱、显色 (1)~(70%甲酰胺/2×SSC)放入水浴中预热至74℃,将一支干净的温度计插入变性液中以确认温度达到了74℃,注意冷玻片插入变性液中将降低变性液的温度。(2)将玻片插入预热的变性液中3~4min,不要摇动,然后迅速将玻片插入预冷至-20℃的酒精中,依次从70%、90%到100%酒精中各脱水2min。(3)将探针于37℃保温5min,轻轻振动后短暂离心收集液体于管底(不要变性探针)。(4)用刻字笔将标本周围划线,加上10μl探针。盖上盖玻片,在盖玻片周围封上一层rubbercement,将玻片置于湿盒中于37℃杂交过夜。荧光原位杂交技术(5)在水浴中预热40ml洗脱液(50%甲酰胺/2SSC)至43℃,将一支干净的温度计插入洗脱液中证实温度达到43℃。(6)用镊子小心地除去rubbercement,小心揭开盖玻片,将玻片插入洗脱液中洗脱10min,然后再重复一次。洗脱液的温度对于信号强度与特异性非常关键,洗脱液温度不能低于43℃。以免由于交叉杂交导致背景产生。(7)将玻片在37℃的2×SSC中洗脱2次,每次4min。(8)将玻片置于室温SSCT液中洗脱2min。(9)将玻片取出,用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT,不要让玻片干掉,以免由于检测试剂的非特异性结合导致高背景荧光。(10)在每块玻片上加上30μlavidin-FITC,盖上盖玻片,37℃孵育20min。(11)小心去除盖玻片,将玻片在室温SSCT中洗脱3次,每次2mi(12)用纸巾从玻片