免疫组化实验步骤.doc

免疫组化实验步骤————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: 石蜡切片免疫组化实验步骤石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行(From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案):1)材料的准备在本实验室条件下推荐使用FAA(50%ethanol,5%aceticacid,%甲醛)固定材料。FAA固定液(100ml),室温保存:无水乙醇50ml冰醋酸5ml37%甲醛10ml水35ml第一天:组织固定用FAA固定,详见“石蜡切片”protocol。第二天:脱水 Solution time numberofchanges50%ethanol 60minutesone60%ethanol 60minutesone*70%ethanol 60minutesone以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待,并不时轻摇。*组织可在70%ethanol4℃可存放几个月第三天:进一步脱水和浸蜡以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇Solutiontimenumberofchanges85%ethanol60minutesone95%ethanol60minutesone以下所有步骤在室温进行并不时轻摇Solutiontimenumberofchanges100%ethanol 30minutestwo100%ethanol 60minutestwo25%二甲苯,75%ethanol 30minutesone50%二甲苯,50%ethanol 30minutesone75%二甲苯,25%ethanol+番红 30minutesone100%二甲苯60minutestwo100%二甲苯+1/4volumeParaplastPlus(paraffin)chipsovernight(不要摇动) 准备工作:60℃预热plus蜡片(ParaplastPlus)石蜡可反复融凝而去气泡第四天:浸蜡2将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液,过夜。第五天:浸蜡3换蜡两次(ParaplastPlus)第六天:浸蜡4换蜡两次(ParaplastPlus)第七天:浸蜡5换蜡两次(ParaplastPlus)准备工作:60℃预热Regular蜡片(ParaplastRegular)第八天:包埋(包埋块可长久保存)第九天及之后:开始切片,切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度,在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子,烘片过夜。用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料,放在烘箱烘干待用。第二天:开始脱蜡(From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol)Solutiontimenumberofchanges100%二甲苯10minutestwo100%ethanol1-2minutestwo95%ethanol1-2minutesone90%ethanol1-2minutesone80%ethanol1-2minutesone60%ethanol1-2minutesone30%ethanol1-2minutesonewater1-2minutesonePBS(