酵母双杂交.pptx

酵母双杂交学生:qxcr专业:@@@@学号:*************酵母的特性?酿酒酵母(haromyces cerevisiae)?真核生物的大肠杆菌?基因组小?有典型的真核生物的转录后修饰过程?一个酵母可同时兼容几个不同质粒(带有2μm复制子)酵母双杂交系统Yeast two-hybrid system?1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。?以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。转录激活因子GAL4的特点?N端含有核定位序列(NLS)和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UAS)相结合的DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)?C端含转录激活结构域(activating domain, AD)?功能上相互独立又互相依赖,只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性GAL4激活转录过程GAL4转录激活因子基因转录翻译GAL4DNA binding domain结合结构域Activating domain转录激活结构域UAS上游激活序列激活转录激活转录DBDADDBDADDBDADGene设计思路XYDBDXADY蛋白是否相互作用?构建UAS上游激活序列报告基因DBDYXADADYDBDXADY激活转录表达报告基因产物DBD-X融合蛋白AD-Y融合蛋白即:DBD-X为诱饵蛋白,AD-Y为猎物蛋白构建一般步骤UAS上游激活序列报告基因lacZβ-:Trp与Leu缺陷型,即酵母菌自身不能合成Trp和Leu,需要从培养基中吸收Trp和Leu。AmprTRP12μori酵母细胞复制起始点DBDPXTTerminator终止子Promoter启动子AmprLEU22μori酵母细胞复制起始点YTADPTerminator终止子Promoter启动子用X的cDNA构建DBD-X穿梭表达载体用Y的cDNA构建AD-Y穿梭表达载体第一次转化-Trp培养基筛选-Trp/-——蓝白斑UAS上游激活序列报告基因lacZDBDXADY激活转录表达lacZβ-半乳糖苷酶X-gal白色蓝色-Trp/-Leu培养基-Trp/-Leu/+X-?从酵母中分离质粒然后转化E. coli?从大肠杆菌中提取质粒并测序?在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性