实验三葡聚糖凝胶柱层析PPT讲座.ppt

1、目的与要求:、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理; 、掌握葡聚糖凝胶(Sephadex)柱层析的操作技术。2、凝胶层析法的原理:凝胶层析是一种液相层析,机理是分子筛效应。当洗脱开始以后,小分子可进入凝胶颗粒内部,流程长,流动慢;大分子不能进入凝胶颗粒内部,流程短,流动快。这样就可使大小不同的分子分开。Vt(totalvolume) Vo(outervolume) Vi(innervolume) Ve(elutionvolume) Vg(gelvolume) Vt(床体积)=Vo+Vi+Vg, Ve(洗脱体积)=Vo+Kd×Vi。介绍几个体积:Kd是分配系数:用于衡量物质在凝胶内外的分配率,是凝胶层析的一个特征常数,只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关,与层析柱的长短粗细无关。Kd值的计算:Kd=(Ve-Vo)/Vi几个特征Kd值意义: ①Kd=0,则Ve=Vo,全排阻; ②Kd=1,则Ve=Vo+Vi,全掺入; ③0<Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi,部分掺入; ④Kd>1,则Ve>Vo+Vi,Sephadex 对它们有吸附作用。如某些芳香族化合物(Phe,Tyr,Trp等),、影响凝胶层析分离的因素:1、样品的体积、粘度; 2、层析柱;(高度,内径,材质) 3、洗脱液流速的影响过慢:扩散过快:拖尾 4、洗脱液离子强度、PH的影响。、样品的体积、粘度:分析分离时:Vsample=1-4%Vbed;制备分离时:Vsample=25-30%(Vsep):相邻两组分Ve之差,用于衡量相邻两组分的分离效果。 Vsep=Ve1-Ve2,当Vsample<Vsep时,则相邻两组分可完全分离。相对粘度:样品液粘度与洗脱液粘度的比值。分离效果只与相对粘度有关,一般来说, ―2。今天的上样量()约为1%柱床体积。、层析柱:①柱长:组别分离时,5-30厘米; 分级分离时,可长至100厘米; ②柱径:分析分离时,由于样品量少, 常使用1厘米直径的层析柱,若制备分离时样品量大,最好使用直径2-3厘米的层析柱。今天选用的是1cm×30cm的层析柱。、洗脱液的离子强度和pH值的影响:多糖类,水是最佳洗脱剂;蛋白类,离子强度>, 以消除凝胶的吸附作用;PH>7时,酸性物质易被洗脱;PH<7时,碱性物质易被洗脱。、凝胶层析法的应用:1、分子量的测定用已知分子量的标准蛋白洗脱制备标准曲线。2、分离多组分混合物3、脱盐与分离纯化用于脱盐的凝胶多为大颗粒、高交联度的凝胶。此时,溶液中大分子(如蛋白质)的kd=0,盐类的kd=1,易于分离脱盐。如:用于去除热原物质热源是微生物产生的某些可以使人发热的物质,多为内毒素,是制药中必须去除的物质。内毒素是一个含脂肪A、糖类和蛋白,是带负电的复合大分子。内毒素经常是多聚体,凝胶过滤层析可有效地将之去除,特别是在小分子药物。选用的凝胶可以与脱盐类似,只是此时热源等大分子物质的kd=0,而小分子药物的kd=1