实验十 PEG法诱导鸡血细胞融合.ppt

实验十PEG法诱导鸡血细胞融合CollegeofLifeScienceandTechnology,XINJIANGUnivercity一、实验目的了解聚乙二醇(PEG)诱导体外细胞融合的基本原理。通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验,初步掌握细胞融合的基本方法。二、实验原理细胞融合(cellfusion)又称体细胞杂交,是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞,随后,异核体同步进入有丝分裂,核膜崩溃,来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞(hybridcell)。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。依据融合过程采用的助融剂的不同,细胞融合可分为:病毒诱导的细胞融合,如仙台病毒(hemagglutinatingvirusofJapan,HVJ);化学因子诱导的细胞融合,如聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG);电场诱导的细胞融合;激光诱导的细胞融合。聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构,使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组,由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用,使细胞发生融合。细胞融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。、材料和试剂仪器、用具:注射器、刻度离心管、离心机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。材料:成年家鸡。(1)%NaCl溶液:(2)GKN液:,,·2H2O,·H2O,,,溶于1000ml重蒸水中。(3)50%(m/v)PEG溶液:取50gPEG(相对分子量=4000)放入100ml瓶中,高压灭菌20min。让PEG冷却至50-60℃,勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN液,混匀,置37℃备用。(4)Hanks原液(10×):;Na2HPO4·;;;MgSO4·;;。■,融于30-50ml的重蒸水中。取1000ml的烧杯及容量瓶各一个,先放重蒸水800ml于烧杯中,然后按上述配方顺序,逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后,方可加入下一药品,直到葡萄糖完全溶解后,再将已溶解的CaCl2溶液加入,最后加水至1000ml。(6)Hanks液:Hanks原液100ml,加重蒸水896ml,%酚红4ml。配好的Hanks液,分装包扎好贴上标签,经过灭菌后,4℃保存。(7)詹纳斯绿染液。(一),从家鸡的翼根静脉用注射器采血,注入试管后,速加入肝素(100U肝素/5ml全血)混合,制成抗凝全血。,%NaCl溶液,制成红细胞储备液,置于4℃冰箱内可供一周内使用。3、鸡血细胞悬液的制备取细胞悬液1mL,%NaCl溶液混匀,1200r/min离心5min,弃上清液,%NaCl溶液按上述条件离心两次(5分钟,10分钟)。最后,弃去上清液,加入10ml的GKN溶液,制成鸡血细胞悬液。,。四、方法与步骤