条件性基因敲除和敲入教育课件.ppt

在科学研究中,为了明确某一组织或器官的功能,常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除,进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。生命科学发展到今天,人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平,而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然有效。具体地说,就是在分子水平破坏想要研究的基因,然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等,进而推测相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(geneknockout)。此外,为了研究某种疾病与某个基因之间的关系,常向生物体内人为引入某个基因,然后观察实验动物出现的各种变化,从而推测疾病与基因的关系,这种研究方法称为基因敲人(geneknockin)。实现基因敲除的方法有多种,但基本上都是采用同源重组或随机整合的方法,让一段没有生理功能的DNA片段在细胞内取代正常基因,从而破坏正常基因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESC)水平进行操作。胚胎干细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系,在体外培养时保持了未分化状态,可以传代增殖,在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞,具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分子水平的基因操作,之后再使这种已经发生了基因改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可以在整个生物体内实现预期的基因改变。经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下:选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片段,通过分子生物学方法使其产生突变,然后与相应的载体进行重组,成为靶载体。分离试验动物的胚胎干细胞,在体外将上述靶载体导入到胚胎干细胞内,使其与细胞内相似或相同的序列进行同源重组,替代细胞内原来的基因。通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细胞,再将其注入囊胚腔内;把经过上述处理的囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内,使其发育成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后,通过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。一、条件性基因敲除的策略——Cre/:于1981年从P1噬菌体中发现,属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp(EMBL数据库登录号X03453),编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶,能介导两个loxP位点(序列)之间的特异性重组,使loxP位点间的基因序列被删除或重组。loxP(locusofX-overP1)序列:来源于P1噬菌体,是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成,8bp的间隔序列同时也确定了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合,13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下:Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程,可以分成三种情况:1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上,且方向相同,Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间的序列;2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上,但方向相反,Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序列倒位;3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上,Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。,是由该系统的诸多优点决定的:①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后,可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程,因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子;②loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成;③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用;④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下,从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。