动物细胞培养实验.doc

实验一:实验器材准备【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作,避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立,各自完成培养过程中的不同操作。【实验目的】培养室的设置和设备。无菌概念和无菌操作要领。【操作步骤】(1)配液室(2)准备室(3)培养室培养室内要完全密闭,保持恒定的温度,在设计上要注意以下几点:培养室的位置最好设在阴面,阳光不能直接照射的地方,防止室内温度增高。天花板的高度不要超过2米,以保证紫外灯的有效杀菌效应,门一般用拉门,以防止空气流动。天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角,要镶瓷砖或涂油漆,这样设计,一是便于清洗和消毒,另外也不易在墙角堆积灰尘。(1)准备室的设备双蒸馏水蒸馏器:制备双蒸水。酸缸:盛洗液,浸泡玻璃器具。干燥箱:洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。高压锅:玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。储品柜1:放置未消毒物品。储品柜2:放置已消毒物品。准备室注意事项:①预防蒸馏器被烤干。②勿将酸液溅到衣物或地面。③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。(2)配液室的设备天平(扭力天平和电子天平):称量用pH计。磁力搅拌器。(3)细胞培养室的设备超净工作台:超净工作台的种类很多,有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等,其工作原理是利用鼓风机,使通过高效滤气的空气,徐徐通过台面,这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。根据层流方式的不同,超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种,基本原理大致相同,都是将室内空气经粗过滤器初滤,由离心风机压入静压箱,再经高效空气过滤器,由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌,从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。使用超净工作台应注意的几点问题:,最好为隔离好的无菌间内,以免尘土过多易使滤器阻塞,降低净化效果,缩短使用寿命。,工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作,再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。,应先用75%酒精擦洗台面,并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。,以保持洁净气流型不受干扰。,高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作,以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过布(无纺布)拆下清洗,时间应根据环境洁净程度而定,通常间隔3~6个月进行一次。,并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。4℃冰箱和低温冰箱:CO2培养箱:,尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用(5%)。。适用于开放培养,培养箱封口后,可在一般恒温培养箱内培养,但是采用培养皿或多孔板培养时,则需要高湿度和高CO2含量的空气。,箱体内装有水浴,可以保证培养箱内的湿度。。。(二氧乙酸)。可防止因CO2培养箱中湿度较高,易长霉菌。离心机:CO2钢瓶:液氮罐:储品柜:用来存放杂物紫外灯:(1)无菌室的灭菌:紫外灯无人时就要打开;进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩;每周清洗消毒一次;所用物品要以外科手术方式严格消毒;室内台面要要保持洁净,做完实验后,用75%酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等;所用物品要一次性准备好;瓶口要用酒精火焰消毒;尽量减少出入。(2)实验人员的无菌准备:肥皂洗手穿好隔离衣酒精棉球擦手【思考题】。?实验过程中如何才能在头脑中形成良好的无菌概念?实验二:动物细胞前处理【实验原理】培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织,将组织取出来后,先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞,然后配制成一定浓度的细胞悬浮液,再将该悬浮液放入培养瓶中,在培养箱中培养,这个过程称为原代培养。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖,培养瓶中的细胞越来越多,需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来,配制成细胞悬浮液,分装到两个或两个以上的培养瓶中培养,这称为传代培养。实验三:动物细胞培养用液的配制【实验原理】熟练掌握培养基(RPMIl640和DMEM)的配