细胞生物实验报告.doc

--------------------------校验:_____________-----------------------日期:_____________细胞生物实验报告细胞生物学实验论文年级:2012级师范2班姓名:田金梅学号:2220**********指导老师:魏玲人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析(西南大学生命科学学院重庆400715)摘要:细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术,掌握细胞培养技术有利于我们掌握一种非常重要的实验技术方法。本次实验通过用人体外周血淋巴细胞为材料,进行PHA处理然后再37℃下培养72小时,并在离培养终止3~4小时添加秋水仙素处理,然后经过低渗离心固定的反复操作,将细胞收集以及处理成合适的装片,然后通过冰片滴片的方式,再由Gemesa染液染色,再镜检,找到含46条染色体合适的细胞,再用显微拍照技术拍照,得到的图片经过简单处理,剪切,并测量数据,最后得到核型分析图谱。关键词:细胞培养;PHA;人体外周血淋巴细胞;染色体装片制备;核型分析综述:细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术,也是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验,它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使期生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。近年来发展起来的核移植、细胞杂交、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立,也都需要与细胞培养紧密结合【1—2】。人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞,它们几乎都处于G0或G1期,一般情况下不分裂,但但采用人工离体培养的方法,经PHA(植物血球凝集素)刺激后,能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。然后用Carnoy固定液固定,最后以气干法制片,可获得较好的染色体标本。核型(karyotype)指一个细胞中的整套染色体,按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。在完全正常的情况下,一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。组型(idiogram)是以模式图的方式表示,它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的,是理想的,模式化的染色体组成,代表一物种染色体组型的特征。将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析,确定其是否与正常核型完全一致,称为核型分析(karyotypeanalysis)。这对于探索人类遗传病的发病机理,探讨动物和植物的起源,以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。材料与方法人的静脉外周血(男女各2ml,在校医院添加肝素钠抽取血样)恒温培养箱(1)、电冰箱(1)、高压灭菌锅(1)、离心机(1)、普通光学显微镜(7)、显微摄影的照相机(1)、培养瓶(4)、离心管(4)、移液枪(2)、胶头(4)、滴管(4)、烧杯(4)、试管架、插管(5)、试剂瓶(4),载玻片(10)。肝素、完全RPMI—1640培养粉、秋水仙素、。人体外周血淋巴细胞的培养①接种和培养:在无菌工作台上,打开培养瓶的瓶塞,加入3ml培养基,然后再加入母液为5mg/mLPHA男1女1各加45ul使其终浓度为75ug/ml,男2女2各加50ul使其终末浓度处于83ug/ml,再向每瓶加入血液,轻轻摇匀,置37℃培养箱中培养72h。②培养细胞的秋水仙碱处理:培养终止前3h~4h将新鲜配制的50μg/mL秋水仙素工作液注入培养瓶中,轻轻摇匀,放回培养箱中,继续培养至72h。制片及染色体标本制备①低渗及离心:小心从培养箱取出培养瓶,用吸管将培养后的血细胞混匀,并移至离心管内,以1000r/min离心10min,吸弃上清液,加入8mL37℃约10次,使细胞悬浮于低渗液中,置37℃水浴箱中,温育20min,,使低渗充分。②固定:低渗终止后,加入新鲜配制的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)1mL,预固定2min,打匀,放入离心机内,以1000r/min离心8分钟min,倒掉上清液,继续加入固定液5mL,用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打混合细胞悬液。室温下静置20min,以1000r/min离心8min,倒掉上清液。③重复固定:再加入固定液5mL,用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打成混合细胞悬液,室温下静置20min,以1000r/min离心8min,倒掉上清液。④制片高的距离滴至事先冰冻的洁净载玻片上,每片2~3滴,随即对准玻片吹一口气,以协助细胞的分散,然后在乙醇灯火焰上方过火5秒,最后在烘箱中烘干。⑤染色:将晾干的玻片标本用Giemsa染液染色20min(用1份Giemsa原液加9份pH的磷酸缓冲液),自来水缓缓冲洗玻片,并烘干,镜检。⑥结果观察:取制备好的健康人