抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定.doc

抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定        [11-01-2816:03:00]    编辑:studa20                  作者:周群芳,鞠吉雨,郎景和【摘要】  目的:制备抗人骨桥蛋白(hOPN)的单克隆抗体(mAb),用于其功能研究。方法:构建OPN的原核表达载体pTriEx1hONP载体,转化Tuner(DE3)placI感受态大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达。利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白,纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原。以重组纯化的OPN蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Westernblot等方法检测其特异性,并用免疫组化方法检测了正常月经周期子宫内膜OPN的表达。结果:pTriEx1hONP表达的OPN蛋白主要为可溶性形式,经镍柱纯化后,蛋白纯度可达85%以上。纯化的OPN重组蛋白免疫小鼠后经融合筛选,得到2株稳定分泌抗人OPN的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和5B7,两株mAb的免疫球蛋白亚类分别IgG1和IgG2a。通过ELISA和Westernblot等方法鉴定,抗OPN的mAb能与OPN蛋白特异性结合。通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的OPN的检测表明,子宫内膜腺上皮在增生期、分泌早期,OPN呈弱阳性表达;分泌中、晚期OPN呈强阳性表达。结论:以纯化的重组hOPN为免疫原成功制备了鼠抗hOPN的mAb,并初步进行了应用,为研究hOPN的功能打下了良好基础。【关键词】 骨桥蛋白;原核表达;单克隆抗体骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种机体反应性的多功能磷酸化糖蛋白,具有精氨酸甘氨酸天冬氨酸(arginineglycineasparticacid,RGD)序列,可通过该序列与整合素和CD44结合,参与细胞的黏附、迁移等[1]。OPN功能复杂多样,与免疫系统、肿瘤转移、消化系统、泌尿系统、生殖系统、骨组织等关系密切,参与疾病的发生[2,3]。近年来有学者发现子宫内膜、蜕膜等生殖系统也表达OPN,OPN在胚胎的着床、生长发育及分化等方面也起着重要作用,因此OPN在生殖系统疾病中的作用值得近一步研究[4]。我们通过构建OPN的原核表达载体,表达纯化OPN蛋白并制备小鼠抗人OPN蛋白单克隆抗体(mAb),用于OPN的检测,以进一步研究OPN与生殖疾病的关系。 1 材料和方法  材料 克隆用大肠杆菌DH5α本室保存。表达质粒pTriEx1、含人OPNcDNA的质粒pET28ahOPN及表达用大肠杆菌Tuner(DE3)placI由哈佛大学刘思金博士惠赠。6~8周龄的BALB/c小鼠(雌性), 购自中国医学科学院动物所。  方法  表达载体的构建 根据OPN基因序列NCBI(AccessionNumber: NM_000582)设计一对扩增引物扩增人OPN基因编码序列全长:PCR上游引物P1为5′ACATG3′, 引入SacI酶切位点,下游引物P2为5′TCAGAAGATGCAC3′引入XhoI酶切位点。扩增部分为hOPNcDNA序列(AccessionNumbe