蛋白质表达、纯化和晶体结构.pdf

中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构蛋白质表达、纯化与晶体结构专业:药理学姓名:侯静导师:颜光美教授中文摘要第1章非出血活性的五步蛇毒锌金属蛋白酶FII与其内源性三肽抑制剂复合物的晶体结构研究P—I类蛇毒金属蛋自酶可以直接水解纤维蛋向/纤维蛋白原,因而可作为潜在的溶栓药。但是这类酶同时还可水解血管基底膜蛋白,因此可能导致出血副反应。为了更好地了解来源于五步蛇蛇毒的锌金属蛋白酶FII的作用机制,为对其进行结构修饰以提高其药理作用的特异性并减少副反应提供结构方面的信息,我们采用汽相扩散悬滴法制备F11蛋白晶体,并对该晶体进行X-射线衍射分析,,发现一个该酶分子由两个亚结构域组成,并含两个高度保守的特征性序列:锌结合序列H。E。XXH。XXGXXH。和Met—tuc。I。M。。其中N一端结构域占了蛋白全氏的大约3/4,是一个典型的0【邝结构。4个d螺旋围绕着四个平行的和一个反平行的B片层。$SMeL-turn。蛋白水解活性必需的锌离子位于两个结构域之间的fuJ隙中,并与高度保守序列H。E。XXH。XXGXXH。∞中三个组氨酸残基的N￡2氮原子和一个水分子螯合。在电子密度图[:还清晰地看到在活性中心周围有一个三肽,其序列为Lys—Ash—Leu(KNL),通过一些实验证实这一三肽对FII的活性有抑制作用。关键词:蛇毒金属蛋白酶晶体结构三肽抑制剂生些奎堂矍主堂篁迨塞堡旦里童姿:]ZAgkistrodonaczlll23",并发现它对大鼠颈动脉血栓动物模型有良好的溶栓作用。但在高剂量时,rFll还可以降解血管基底膜蛋白,因此存在潜在的出血副反应。我竹j曾经尝试使用毕赤酵母表达的rFIl进行结晶,希望通过晶体结构来解释其作用机理,并利用结构信息来对其进行改造,增加对作用底物的选择性,以减少临床应用的副反应。然而,始终未能得到晶体。推测其原因可能足酵母表达的异源蛋自存在不均一的翻译后修饰所致。大肠杆菌Escherichiacoil()是目前常用的另~个表达异源蛋白的宿主,具有不对所表达的蛋白进行翻译后修饰的优点,。因此我们重新将多个片断长度的rFII基因克隆到大肠杆菌表达载体pETl5b、pET32a及pMALc2x和pMALp2x上,在大肠杆菌菌株BL21(codonplus)和/或OrigamiB中过表达。并采用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析纯化“可溶性蛋白”,或采用尿素或盐酸胍从包涵体中变性并纯化重组蛋白,采用稀释、亲和柱辅助的手段使变性蛋白复性。未能得到可溶性有活性的fill蛋白。关键词:蛇毒金属臻白酶大肠杆菌克隆表达纯化复性第3章芳香烃受体核转位因子2(ARNT2)在大肠杆菌的克隆、表达和纯化bHLH/PAS蛋白超家族(-Arnt—Sireproteins)是在许多重要生理和发育过程基因表达网络中关键的调节因子。ARNT2被认为是bHLH/PAS蛋白家族成员中的通用型配基,主要在中枢神经系统和肾脏表达,可与HIF—l位结合形成二聚体,发挥润控缺氧应答的功能。ARNT2和SIM蛋白形成的二聚体可以调节F丘脑神经内分泌轴的发育进程。为了了解ARNT2在转录调节方面的分子机制,、表达和纯化了大鼠ARNT2(330—711),但是未能得到晶体。关键词:芳香烃受体核转位因子2大肠杆菌克隆表达鳓化中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构第4章PDE9A(催化结构域)在大肠杆菌的表达、纯化及初步的晶体学研究环核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)可以通过降解环核苷酸(cAMP,cGMP)而控制其在细胞内的浓度,从而影响多种生理过程。深入了解PDEs对环核苷酸底物特异性和抑制剂选择性的结构基础可以帮助设计效应更强、副作用更少的PDE抑制荆。我们从大肠杆菌菌株BL21(codonplus)表达并纯化了野生把和突变性PDE9A(催化结构域),并得到了未结合配基的PDE9A、PDE9A和其水解产物GMP、PDE9A和非选择性抑制剂theophyline复合物以及两个PDE9A突变体和底物cGMP复合物的晶体。希望通过这些晶体的结构信息,更好地了解PDE9A对底物和抑制剂的识别和作用机制,以帮助设计选择性更高的抑制剂。关键词:环核:寄酸磷酸二酯酶大肠杆菌表达纯化结晶中山大学博士学位论文蛋白质表达、纯化与晶体结构Expression,Purifica