分子生物学实验技术实验报告.docx

2013年分子生物学实验技术实验报告实验名称:口蹄疫病毒VP1蛋白的表达姓名:学号:班级成绩一、实验目的本实验从口蹄疫病毒核酸的提取、分离、纯化、鉴定等实验技术入手,通过DNA技术、RNA技术和蛋白技术实验技术的应用,训练学生掌握分子生物学的基本试验方法和操作技能,进一步巩固理解分子生物学的基础知识和相关理论,从而为毕业论文选题和开展分子生物学方面的研究项目奠定基础。二、实验材料与器材1、病毒样品:口蹄疫病毒强毒株和阳性口蹄疫冰帝VP1重组质粒2、仪器设备:凝胶图像分析系统、PCR仪、恒温水浴锅、培养箱、高速台式离心机、超低温冰箱、漩涡混合器、微量移液器等3、试剂:pMD-18载体、PCR胶回收试剂盒,反转录试剂盒等4、溶液:LB液体培养基,电泳缓冲液,,氨苄青霉素母液,10%SDS,10%过硫酸铵,-HCL,1MTris-HCL,考马斯亮蓝染色液,脱色液,电转缓冲液,包被液,显色液等三、实验方法(一)反转录聚合酶链反应(RT-PCR)1、,再加入750μL预冷的冰RNAisoReagent。,在室温静置5分钟。,颠倒离心管混合两次,并剧烈震荡混匀,使液体充分混匀呈乳白状(无分相现象)后,再室温静置5分钟。℃条件下,以12000×g离心15分钟。,加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀,然后在室温静置至少10分钟。℃条件下,以12000×g离心15分钟后,小心并尽可能地除去全部上清液。%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁,4℃12000×g离心5分钟后小心弃去乙醇。(不能完全干燥)处理后,用10μL无RNase污染的水(RNase-Freewater)将RNA溶解并于-20℃保存备用。(二)反转录1、反应体系(10μl)如下:组份体积5×、加完后的体系,轻弹混匀,瞬离。3、反应条件:42℃,1小时。4、完成以后进行下一步实验或者放-20℃保存备用。(三)聚合酶链反应(PCR)1、反应体系(25μl):×、设立阳性对照组和阴性对照组。3、加完体系后,轻弹混匀,瞬离,上PCR仪。4、特异性反应条件为:预变性94℃5min变性94℃1min退火55℃1min30Cycles延伸72℃1min终延伸72℃10min(四)PCR产物检测:琼脂糖凝胶电泳1、电泳缓冲液TBE(10×)的配制:称取Tris-base54g,,()20mL,定容至1000mL。2、%琼脂糖凝胶的配制:,加入10mL10×TBE缓冲液,并加水定容至100mL,加热溶解后加入5μLEB(10mg/mL),摇匀后倒入插有梳子的电泳槽,待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。3、电泳检测:取PCR产物5μL于LoadingBuffer1μL混合,加入到琼脂糖凝胶点样孔中,同时在样品孔旁加入5μLDL2000DNAMarker作对照,以100V电压,50mA电流进行电泳,约15min后于紫外灯下观察结果。基因克隆(一)DNA片段与载体的连接1、反应体系(10μL):-、反应条件:16℃,4小时以上。(二)感受态细胞的制备试剂的配制:1、LB液体培养基:称取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,氯化钠10g,溶解于800mL去离子水中,,加去离子水定容至1L,高温高压灭菌20min。2、:(无水,分析纯),溶于超纯水中,定容至100mL,。3、无菌甘油:取甘油100mL,高温高压即可。操作步骤(无菌操作):1、从生长有大肠杆菌DH5α的平板上挑取一个单菌落,接种于2mLLB液体培养基中,37℃200rpm,震荡培养过夜,作为一级种子。2、将一级种子按照1:50比例无菌转接到5mLLB液体培养基中,37℃200rpm震荡培养约2-3小时,。3、