实体组织和细胞蛋白抽提试剂盒.doc

实体组织和细胞蛋白抽提试剂盒货号:P060091描述:从组织细胞中提取总蛋白是WesternBlot的关键步骤。实体软组织如脑脊髓富含磷脂,神经血管含大量结缔组织,而脂肪则有大量油脂,常规的方法难以有效从这些组织提取蛋白。本试剂盒为组织或培养细胞总蛋白提取提供完整的解决方案。用裂解-结合缓冲液匀浆裂解实体组织,或直接用裂解-结合缓冲液重悬培养细胞,然后加入抽提试剂去除非蛋白成分,离心、干燥后即可得到总蛋白。蛋白沉淀溶解后用常规方法进行蛋白定量。提取过程可在30-60分钟内完成,,极为简便高效。通常一次提取10-100mg组织所获得的总蛋白可进行几十到上百次分析如蛋白质电泳、WesternBlot、免疫共沉淀。-结合缓冲液100ml -100mg组织或1´107细胞。试剂盒的裂解缓冲液是过量的。适用各种实体软组织(>1mg),如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道组织、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等,以及各种原代细胞和永生化细胞系。保存:室温或4ºC保存2年固体组织蛋白提取每10--1ml裂解液,放入玻璃匀浆器内上下手动匀浆15次;或用高速机械匀浆器12,000rpm破碎组织。注意:初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高,提取时应加较少量的组织,否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。少量小的未破碎组织不影响后续抽提。,弃去剩余的组织匀浆液。(1ml)抽提试剂充分混匀。室温或4ºC静置10分钟,偶尔晃动。注意:(1)如组织量<10mg,在下一步离心时形成的蛋白膜易碎,静置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪组织时应4ºC静置40min以上以充分去除油脂。(3)。(1ml)抽提试剂是成功的关键。10,000g4ºC离心10分钟,溶液分为上下两相,两相中间为蛋白膜。吸除上层液体;随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜,吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意:(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固,难以溶解。(2)如果不能分相,可再加入50ml蒸馏水混匀离心。(3)如果初始组织量较少(<10mg),离心后难以得到完整的蛋白膜,此时可吸去上下层液体,加入1ml纯乙醇混匀,10,000g4ºC离心3分钟。弃所有液体,蛋白沉淀在管底。敞开管口,室温10分钟空气干燥沉淀。每100mg组织所得到的蛋白加200-1000ml用户自备的缓冲液,95ºC煮10分钟。室温放置20~60分钟溶解沉淀。参见后面的说明。培养细胞蛋白提取参见固体组织蛋白提取程序中的斜体字注解消化洗涤并800g离心收集细胞。每5-,振荡重悬,4ºC净置2分钟。,振荡混匀。4ºC静置10min。10,000g4ºC离心10分钟,溶液分为两相,两相中间为蛋白膜。小心吸除上层相和大部分下层相,保留两相中间的蛋白絮状物。如果不能分相,可再加入50ml蒸馏水混匀离心。加入1ml纯乙醇洗涤沉