钩藤碱对新生鼠原代海马神经元NR1和NR2B表达的影响.pdf

f㈣燃硕士学位论文钩藤碱对新生鼠原代海马神经元NRl和NIGB表达的影响研究背景硕士研究生:贺燕主要导师:彭康教授联合培养导师:周吉银主管药师摘要茜草科(Rubiaceae)钩藤植物是常用中药,被《中华人民共和国药典》2010年版收载,其中正品钩藤包括:钩藤Uncariarhynchophylla(Miq).、大叶钩藤UncariamacrophyllaWall.、毛钩藤UncariahirsuteHavil.、华钩藤Uncariasinensis(OHv.)Havil.、无柄果钩藤UncariasessilifructusRoxb.。其药用历史可追溯到魏晋时期,《名医别录》、《本草纲目》、《药性论》等古籍均有记载。钩藤味甘,性凉,归肝、心包经,具有息风定惊、清热平肝的功效。主治肝风内动,惊痫抽搐,高热惊厥,感冒夹惊,小儿惊啼,妊娠子痫,头痛眩晕,多以复方入药。现代主要用于治疗原发性及继发性高血压、脑神经性疾病及脑血管疾病,还可用于治疗癫痫、老年期痴呆和防治药物依赖。钩藤碱(Rhynchophylline,Rhy)是钩藤中含量最高的吲哚类生物碱,占总生物碱的20"--'30%,其他生物碱还包括异钩藤碱、柯诺辛碱、柯诺辛碱B、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱及柯楠因碱等。现代药理研究表明钩藤碱主要作用于心血管和中枢神经系统,不仅在高血压、心律失常、心肌肥大、血栓等方面具有摘要疗效;而且在脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、癫痫、惊厥、焦虑症、药物依赖方面也具有神经保护作用。,拮抗NMDA受体和AMPA受体,调节谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、内啡肽、。NMDA受体是与ca2+通道偶联的离子型兴奋性氨基酸受体。天然的NMDA受体由NRl、NR2和NR3三种亚基组成的异聚体。其中NR2又分为NR2A、NR2B、NR2C和NR2D4个亚型。NRl是基本的功能单位,NR2决定受体的性质,NR3在NMDA受体中主要发挥抑制作用。NMDA受体广泛分布于脑、脊髓和外周组织。NMDA受体拮抗剂分为竞争性和非竞争性拮抗剂两类。竞争性NMDA受体拮抗剂作用于兴奋性氨基酸的识别位点,如AP5、AP7、CPP等。非竞争性NMDA受体拮抗剂作用于离子通道,如MK-801、氯胺酮、PCP等。非选择性的NMDA受体拮抗剂存在严重的不良反应,包括拟精神病药作用和对运动功能的影响。NR2B选择性拮抗剂,如:艾芬地尔、依利罗地、氟哌啶醇、苯丙氨酯具有神经保护、抗惊厥、镇痛等作用。NMDA受体的激活可以触发长时程增强和长时程抑制,是大脑学忆、认知、突触可塑性的生理机制。但是,NMDA受体的过度激活也可引发多种中枢神经系统疾病,如脑中风、帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫、亨廷顿舞蹈病、精神分裂症等。有文献报道,钩藤的水提物具有抗焦虑作用。本课题组前期进行的钩藤碱药效学实验表明,钩藤碱(60mg/kg)增加小鼠在5分钟内进入开臂次数和延长在开臂滞留的时间,增加10分钟内的穿箱次数和延长在明箱滞留的时间,证实钩藤碱确有抗焦虑的功效。但是,钩藤碱抗焦虑作用的机制仍未明确。前期研究发现钩藤碱抑制苯丙胺诱导的条件性位置偏爱大鼠杏仁核和伏核中NR2BmRNA和蛋白的表达,且钩藤碱本身无精神依赖作用。还发现钩藤碱抑制NMDA受体钙通道的激活,降低甲基苯丙胺引起的原代皮质神经元胞内的钙超载,具有神经保护作用,提示钩藤碱可能是NMDA受体抑制剂。我们推测,硕士学位论文钩藤碱抗焦虑作用可能与NMDA受体有关。研究目的钩藤碱不仅在高血压、心律失常、心肌肥大、血栓等心血管方面具有疗效;而且在脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、癫痫、惊厥、焦虑症、药物依赖等神经系统方面具有保护作用。的钩藤碱药效学预实验证实,钩藤碱具有抗焦虑的作用,但机制尚未明确。药物依赖的药理学实验表明,钩藤碱可能是NMDA受体抑制剂。钩藤碱是否通过调节NMDA受体发挥抗焦虑效应是本文关注的重点。鉴于以上分析,在本课题组前期研究的基础上,本文以原代培养的新生鼠海马神经元为研究对象,从定位、定量、定性三个角度观察钩藤碱对NMDA受体NRl、NR2B亚基的影响。:取24h内的SD新生鼠,急性处死,钝性分离左右海马,剥去脑膜,剪成粥糜状,%胰酶于37。C消化30min,终止消化后,轻轻吹打至组织块消失。所有操作在冰上进行。将细胞悬液过200目筛网,离心。种植培养基调整密度为5x105个/ml,按2ml/孑L接种于6孔板中。37。C,5%C02孵箱中孵育。12h内换维持培养基,以后每4天半量换液。倒置显微镜下观察神经元的生长情况。神经元特异性烯醇化酶鉴定。在显微镜下观察,随机选取五个视野,计数每个