外泌体提取方法总结.doc

细胞培养上清:即在4℃下,首先300×g离心10min,吸取上清液,然后2000×g离心10min;吸取上清液后,10000×g高速离心30min,吸取上清液;140000×g超速离心90min;除去上清液,所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后,140000×g再次离心90min,100μLPBS缓冲液重悬沉淀,冻存于-80℃备用。,并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。此后,将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g离心10分钟。将上清液以无菌PBS以1:1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟,然后以200,000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS,-μm注射器过滤器过滤,并以200,000×g离心1小时,然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。为了从体液(例如尿液,支气管肺泡灌洗液,血清,血浆,肿瘤腹水)中纯化外泌体,只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子,EDTA抗凝,血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天,直至进行外泌体纯化。外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同,但由于某些流体的粘度,必须稀释它们,并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体(Caby等,2005)。基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体(例如,血浆:通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴,血清,尿液,细支气管灌洗或肿瘤腹水)磷酸盐缓冲盐水(PBS;附录)2A)(如Steritop,Millipore)超速离心机和固定角度或摆动式转子()适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶())注意:所有离心均应在4℃下进行。。将稀