林可链霉菌中的同源重组.doc

()华东理工大学国家生物反应器工程国家重点实验室上海200237摘要:为研究链霉菌中的同源整合频率和机制,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE04a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组,经过低抗筛选,。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASma?片段,;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHind?和Sma?联合酶切片段,。,。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在,用Sph?酶切染色体DNA后连接,,在氨苄抗性板上得到2个转化子,命名为pSLE1。对其进行酶切鉴定的结果表明它是转化质粒pYYE04a1的一部分。关键词:林可链霉菌,同源重组,同源整合,同源交换()文章编号:000126209200**********中图分类号:Q933文献标识码:A1利用DNA重组技术改良抗生素生产菌可以采用基因回转化的战略,即将携带抗生素生物合成关键酶基因的质粒转化回生产菌中,通过与染色体的同源整合增加关键酶基因的拷贝数。为了进一步探讨这种方法的可靠性,我们研究了林可链霉菌B48株林可霉素生物合成基因的同源整合现象。目前已有几种利用质粒在染色体上引入同源重组基因的方法:()源性在30?发生重组,随后在质粒复制不允许温度的44?下筛选重组子;Hillemannr等人利用单链DNA整合载体转化Streptomycesviridochromogenes,被ts灭活的pat基因置换3了染色体上的同源基因,产生无法合成PTT的突变子;Gutterson等人利用缺失DNA聚()合酶IpolA的菌株无法复制含ColE1的复制子的特性,用大肠杆菌复制子转化沙门氏菌,染色体的che基因与质粒上被抗性基因灭活的che基因之间发生同源重组并得到突变4子,同时随着培养基中抗生素浓度的提高,整合到染色体上的质粒序列可以扩增30倍。本文利用不被链霉菌DNA聚合酶识别的大肠杆菌质粒转化林可霉素生产菌Streptomyceslin2colnensisB48,质粒上被抗性基因灭活的林可霉素合成基因与染色体的同源基因重组得到突变子,并用低硫链丝菌素抗性、杂交及回连染色体酶切片段的方法验证了同源重组的发生。3()国家自然科学基金资助项目29476235()作者简介:唐雅1977-,女,安徽省人,硕士,毕业于华东理工大学应用生物学系,主要从事分子生物学方面的研究。收稿日期:2000212220,修回日期:-rΔ())Δ()(11111菌株:,ara,lac2proAB,rpsl,Srt,F80,d,lacZ,M15,,dcm,supE44,hsdR17,thi,leu,rpsL1,lacY,galK,galT,ara,tonA,Δ()thr,tsx,lac2proABΠF′]。α质粒:大肠杆菌质粒pUC18amp,lacZ2]、pSPORT1amp,lacOPZ′,sp6,T7、11112ΔΔΔαpESE701tsr,lmbFlmbGlmbHlmbIlmbJlmbKlmbL,amp,lacZ2]和链霉菌质粒pIJ702mel]由本课题组收藏。、林可霉素生产菌培养基SMA、液体培养基SM和YEME,原生质体再生培养基RYE的成分参见文献5。、连接酶及其缓冲液为TaKaRa公司产品。硫链丝菌素系Sigma公司产品。RNA酶和蛋白酶K购自上海实生生物技术公司,氨苄青霉素系苏州益良药业有限公司产品。原生质体转化和再生所用的P缓冲液、T缓冲液及链霉菌染色体5抽提的A缓冲液均按Hopwood方法配制。1