DNA分子标记在中药材鉴定中的应用研究.pdf

巾文摘要中文摘要中药品种的准确鉴定是中药质量控制的首要环节。现有的鉴别方法仍1i能解决一些品种鉴定难的问题。如缺乏特征性理化成分的动物类药材、多来源药材、栽培后产生众多变异类型的药材等。DNA分子标记方法的逐步成熟,使得中药材以客观指标为依托的现代质量评价方法得到了有益的补充,提供了解决上述难题的可能性。针对上述难点,本文探索使用多重位点特异引物PCR年HISSR—PCR方法鉴定中药材近缘混淆品种及多来源品种,并对各种PCR反应体系进行优化,建立了特异、稳定、快捷的中药材分子鉴定新方法。本论文主要分以下三方面内容:一、中药材DNA提取方法的探讨本次研究选取具有代表性的含淀粉、多糖较多的人参、西洋参、半夏、天花粉药材,在常规CTAB法基础上加以改进,·L~,有效地去除了淀粉和其他多糖;延长温育时间至2h,小使用液氮研磨样品,提取缓冲液配方中省去巯基乙醇、PVP等成分;用高纯水溶解DNA沉淀;提取步骤为:温育、氯仿萃取、沉淀;使操作简化从而降低中药材DNA提取难度。二、中药材位点特异性PCR方法鉴别本文建立了多重位点特异性PCR方法鉴别中药材人参、西洋参。应用人参鉴别引物PgS481F和PgS712R和西洋参引物PgS481F和PqtK896F,对样品DNA进行PCR扩增,对反应体系优化,依据各自的特异条带进行鉴别。结果当退火温度为66。C时,卜H现249bp条带的为人参,i049bp条带的为西洋参。并使用20个不同来源的人参、西洋参样品进行验证实验。该法能在同一次PCR反应中准确地鉴别人参、西洋参。多重位点特异性PCR方法用于中药分子鉴定。使用该法经一次PCR反应成功地鉴别了人参与西洋参,半夏及其混淆品,虎掌南星及其混淆品,动物类药材虎骨、豹骨及其混淆品。位点特异性PCR方法鉴别半夏及其混淆品。应用半夏鉴别引物PtITsF和PtITsR对半夏5个产地的新鲜样品、10个产地的药材以及5批虎掌、水半夏样品进行PcR检测。当退火温度为62℃时,只有半夏正品能够扩增395bp条带,所有混淆品无扩增。应用虎掌南星鉴别引物Pprpll48F和Pprpl480R,当退火温度为65℃时,仅有虎掌南星扩增351bp条带,其它混淆品无扩增。应用虎骨鉴别引物PtCytbF和PtCybR对4个虎骨、lO个豹骨及各自的混淆品进行鉴定。当退火温度为52。C时,只有虎骨在326bp扩增条带,混淆品无扩增。豹骨鉴别引物Pp3F年NPp3R对样品扩增,当退火温度为59℃时,只有豹骨出现374bp条带,混淆品无扩增。三、多来源中药材ISSR_PCR方法鉴别本次研究对药典多来源药材的鉴别做了初步的探索研究。应用简单重复序列间扩增方法鉴别三来源甘草、两来源黄芪、三来源大黄。实验中对ISSR—PCR反应体系和参数进行优化。经过对40个ISSR弓I物的筛选,当退火温度为55。C时,引物UBC826可以鉴别二三来源甘草;引物UBC866可以鉴别两来源黄芪;引物UBC818可对三来源大黄进行鉴定。通过本次研究得到如下结论:,使用改进CTAB方法成功地从含淀粉、多糖类的典型药材人参、西洋参、半夏、天花粉中提取到基因组DNA,所得DNA提取液纯度高,得率增加,完全满足下游PCR实验的要求,将中药材DNA提取步骤简化。(SNP位点),建立多重位点特异性PCR方法鉴定中药材。使用人参、西洋参各自的特异性鉴别引物,经一次PCR反应成功地将二者鉴定。并且验证了该PCR反应适用于/1i同产地人参、西洋参的药材、饮片、标本的鉴定。方法的特异性高、重复性和稳定性好。,虎掌南星及其混淆品,动物药材虎骨、豹骨及其混淆品。其中对于名贵的动物类药材虎骨、豹骨为首次利用分子标记方法进行鉴定。为今后缺乏特征性理化成分及以器官组织入药的动物类药材的鉴定奠定了基础。、光果甘草、胀果甘草的药材进行了鉴定,并将该方法成功地推广到两来源蒙古黄芪和膜荚黄芪、三来源掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄的鉴定中。为分子标记更广泛地应用于多来源中药材的鉴定奠定了基础。,其中第一作者文章2篇,分别为《乌梢蛇及其混淆品高特异性PCR鉴别》、《蕲蛇及其混淆品高特异性PER鉴别》。申请专利一-项《乌梢蛇及其混淆品高特异性PCR鉴别》。关键词:中药鉴定;DNA分子标记;位点特异性PCR(AS-PCR);简单重复序列间扩增(ISSR);单核苷酸多态性(sNP)ABSTRACTVABSTRACTThestandardizationandmoderniz