口蹄疫—伪狂犬病二价和口蹄疫—猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗研究.pdf

旦堕壅二垡堡垄堑三塑量旦堕壅一猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗的研究中文摘要口蹄疫、猪细小病毒病与伪狂犬病是危害全球养猪业的三种重要传染病,分别由口蹄疫病毒(,rMDV)、猪细小病毒(porcineparvovirus,PPⅥ、伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)弓I起。当前猪细小病毒病和伪狂犬病等猪繁殖障碍性传染病在我国很多猪场流行,造成大量死胎、流产及猪生产能力下降,危害严重。口蹄疫则是人畜共患的急性、烈性传染病,由于其传染性极强,而传统灭活疫苗在生产使用过程中有灭活不彻底导致病毒逃逸工厂而发生口蹄疫的风险,因此口蹄疫基因工程疫苗的研究受到高度重视。伪狂犬病病毒具有不感染人、基因组容量大、重组病毒遗传稳定等特点,适合改造成表达外源基因的活病毒表达载体,以伪狂犬病病毒基因缺失株为表达载体构建基因工程疫苗,将其它病原的保护性抗原基因插入PRV基因缺失疫苗株中,就可构建成二价或多价基因工程疫苗,从而在猪场疫病免疫中起到~针防多病的作用。,。'/LacZ+基因组共转染,-/gE/-3C,并用空斑筛选与PCR鉴定的方法纯化重组病毒。进行Westernblot鉴定和测定重组病毒在不同细胞上的增殖滴度,结果表明重组病毒构建正确且外源基因获得有效表达,其增殖滴度与亲本株相比差异不明显。遗传稳定性和安全性检测表明重组病毒稳定性、安全性良好,重组病毒免疫BALB/c小鼠后用EuSA检测血清中FMDV抗体,并测定FMDV中和抗体效价,结果表明重组病毒可诱导小鼠产生明显的免疫反应,从而为伪狂犬病与口蹄疫二价基因工程疫苗的研制应用打下基础。—,,经PCR和酶切鉴定证实质粒构建正确且两个表达框为反向插入。采用脂质体介导法将pⅢ+基因组共转染,'/gE/,并华中农业大学博士学位论文用空斑筛选与PCR鉴定的方法纯化重组病毒。对重组病毒进行Westernblot鉴定,结果表明口蹄疫病毒P1-2A前体与猪细小病毒VP2蛋白均得到了有效表达,测定重组病毒在不同细胞上的增殖滴度,其增殖滴度与亲本株相比差异不明显。安全性检测表明重组病毒安全性良好,重组病毒免疫BALB/c小鼠后经FMDV、PPV、。重组病毒免疫小鼠后进行伪狂犬病病毒的攻毒试验,其结果初步验证了重组病毒对伪狂犬病的保护效力,从而为口蹄疫一猪细小一伪狂犬病三价基因工程疫苗的研制、应用打下了基础。关键词:口蹄疫病毒伪狂犬病病毒猪细小病毒重组伪狂犬病病毒基因工程疫苗旦婶疫—伪狂犬病二价与口蹄疫一猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗的研究AbstractPseudorabies(PR),foot-and·mouthdisease(FMD),-deletedpseudorabiesvirus(PRV)ineforeradicationprogramofPRandalive—,binantplasmidplEPI-2A-3CwasconstructedbyinsertingtheP1-'/gE'/LacZ*strainandplEPl—2A-3Cwereco-transfectedintoPK-tion,binantvirusPRVⅨ|毫E汪1—2A-3CwasscreenedoutwithPCRmethodbyexaminingPI·2A-