荧光定量PCR完全攻略.doc

荧光定量PCR完全攻略.doc荧光定量PCR完全攻略荧光定量PCR完全攻略1、什么是定量PCR?以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,、定量PCR定量的理论依据是什么?特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,则无论原来样品中起始模板含量多少,:Y=X*2n其中Y代表扩增产物量,X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数;理论上PCR扩增效率为100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈2的倍增长;实际应为:Y=X(1+E)n,其中E代表扩增效率:E=参与复制的模板/总模板,通常E≤1,~105拷贝、循环次数n≤30时,E相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30次),E值逐渐减少,Y呈非固定的指数形式增加,、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么?PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量,使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,,研究了相对准确的定量PCR方法,:①Tn=T0(1+E)n②Tn=Tn-1(1+E)n注:[0<E<1]其中E表示扩增效率,n为循环数,Tn表示在n个周期后PCR产物的数量,Tn-1表示在n-1个周期后PCR产物的数量,,产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量,即特定的拷贝数K,为常数,大约在1010左右)高于背景为仪器所识别,此时的循环数为CP(crossingpoint),也就是K=T0(1+E)CP,取对数即:lgK=lgT0+CP*lg(1+E)CP=-1/lg(1+E)*lgT0+lgk/lg(1+E)由于对一特定的PCR而言,E与K均为常数,故上式为循环数(CP)对原始模板拷贝数的对热线电话:021-5446083**********E-mail:******@.cn网址:数(lgT0)一次方程,其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为-1/lg(1+E),在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E),-PCR的标准曲线:目前荧光定量PCR均采用外标定量外标法定量PCR扩增效率的计算,由于标准曲线的斜率(Slope)为-1/lg(1+E),可知E=10-1/Slope-1,如从标准曲线中知道Slope=-,则可推知扩增效率E=101/-1=,也有作者将(1+E)直接视为扩增效率E,则E=10-1/Slope,求得的E值均在1—2之间,有时也有大于2的结果,,例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2,N3=(10*