致泻大肠埃希氏菌检测操作程序.docx

致泻大肠埃希氏菌检测操作程序范围本程序规定了粪便标本中致泻大肠埃希氏菌(DiarrheagenicEscherichiacoli)的检验方法。操作步骤标本收集标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本,仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测,需要在拭子上明显见到粪便。所采集的标本尽快检验,放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中,冷藏条件下8h内送检。直接分离培养新鲜粪便:无菌拭子采集少量粪便,尽量从可见血或黏液的部位收集;新鲜拭子在MAC一区划线;以1µL无菌接种环或接种针划线分离。肛拭子:操作程序同新鲜粪便。转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子:轻搅混合标本;拭子在MAC一区划线;以1µL无菌接种环或接种针划线分离。平板36℃±1℃培养18h~24h。菌落特征挑取5个可疑大肠埃希氏菌菌落(粉红色、突起、光滑、湿润)直接保存半固体菌种管;采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌。多重PCR鉴定标准菌株标准菌株一览表见表3。44155中国食品药品检定研究院STEC具有stx1、25922WHO引物合成多重PCR引物序列见表4。五种致泻大肠埃希氏菌目的基因引物序列目标菌目标基因引物序列片段大小(bp)EPEC、STECescV–F5′-ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3′544escV–R5′-TTTTACAAACTTCATCGC-3′EPECbfpB–F5′-TCATTGCTGAAGTCG-3′910bfpB–R5′-GTTATGC-3′STECstx1A–F5′-CGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGC-3′244stx1A–R5′-AGAATTG-3′stx2A–F5′-ATCTTCGTCTGATTATTGAG-3′324stx2A–R5′-AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC-3′ETECElt–F5′-GAACAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTG-3′655Elt–R5′-CTTTCAATGGCTTTTTTTTGGGAGTC-3′estIa–F5′-CCTCTTTTAGYCAGACARCTGAATCASTTG-3′157estIa–R5′-CAGGCAGGATTACAACAAAGTTCACAG-3′estIb–F5′-TTTCGCTC-3′171estIb–R5′-CGGTACAAGCAGGATTACAACAC-3′EIECinvE–F5′-TAACAGAAGAATCAC-3′766invE–R5′-G-3′EAECastA–F5′-G-3′102astA–R5′-AT-3′aggR–F5′-TGATAAAG-3′400aggR–R5′-AATACAGAATCGTCAGCATCAGC-3′Pic–F5′-GACGATTGG-3′1111Pic–R5′--3′通用uidA–F5′-AAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTG-3′1487uidA–R5′-AGCGTTTTTGC-3′标本处理刮取营养平板上的过夜新鲜培养物1环~2环,%灭菌生理盐