蛋白纯化经验指南.doc

:..蛋白纯化经验指南推荐书籍:《蛋白纯化与实验鉴定指南》、《生物工程下游技术》、《酶工程》、《酶制剂工业》1)我现在手头有个融合蛋白,纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析,之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列,没有问题。细胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有50~60%左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀,%CHAPS助溶可勉强溶解部分,目的蛋白疏水性比较强。既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性,这样溶解就会好得多,此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性,同时保护你的蛋白,你再做纯化就可以了,我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000,这样的情况下蛋白还是活性回收率很高,我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底哪里失去了活性,这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值,看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点,这也是个办法。2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶?亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好,,那我还可以建议你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似,,,请查收,现在一般要自己合成亲和填料,有很多公司都提供活化好的介质,自己偶联就可以,其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶,环氧琼脂糖凝胶,氨基琼脂糖凝胶,羧基琼脂糖凝胶,活化酯琼脂糖凝胶,以及巯基琼脂糖凝胶等,但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好,此外也曾经有文献报导固定辅酶时,偶联位置不同,选择性有差别,因此你可以选择自己适合的活化介质。不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求,所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶,它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以,而且合成的介质刚性好,非特异吸附少,所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定,配基脱落少。我觉得是不错的选择。包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,,,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。3)SephadexG-25(medium)柱脱盐时,盐浓度太高对柱效有影响吗?若有,一般对盐浓度限度如何?大家别客气,除盐对于浓度应该也是有一定的限制的,同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些,相对需要的柱子的分辨率也要高点,但是在正常的范围如1-2M应该影响不大,不过要除得很干净还是尽量少上点样品,我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。4)我的蛋白17kd左右,能跟肝素亲和,一般用离子交换和亲和层析纯化,现在我用聚乙二醇修饰它,分子量增加5000左右,修饰率不可能达到100%,请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开?(当然修饰后还残留有聚乙二醇,这个小分子也要除掉)他们大多用凝胶过滤,我觉得这也不错的做法,毕竟PEG是链状的分子,在柱子上和普通蛋白行为不一样,修饰度越高那么出峰也越后,因此你的蛋白选择sephadexG50试试,它的范围在1000-30000,应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链,修饰后的蛋白疏水性增强,修饰度越高,疏水性越强,可以用这个原理分离。离子交换也可以选择,因为同样道理,修饰度越高,电荷被屏蔽也越多,电荷也越少,因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理,你可以试试,你手头的亲和能不能分开,你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。5)我是个新手,谢谢楼主给我解决了许多难题。我有个问题困绕很久,从细菌中提取酶,好象用常规的方法(超声波破壁,缓冲液提取),总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强,需要加助