免疫金手册.doc

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班技术资料胡东维洪健徐颖浙江大学 2001 年 10月浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 1 一、胶体金的制备根据不同的制备方法,可以制备出直径 1- 500nm 的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在 3-30nm 范围内。在氯化金(HAu Cl 4) 水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂, 可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高, 核浓度也越高, 氯化金的还原也就从更多的还原中心开始, 因此产生的胶体金粒子数量越多, 但体积也越小。粒子直径每增加一倍, 数量减少为原来的 1/8 。以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径 3~ 16nm 的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄, 而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加 ~ %的 H 2O 2 能够去除这些残基。双标记或制备 5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。利用柠檬酸为还原剂,可以制备 12~ 150 nm 直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时, 胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时, 建议使用该方法制备 12-16 nm 直径的胶体金。除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm 的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理, 故该方法已经很少使用。氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存( 或 1g) ,因此在配制氯化金溶液时一次配完, 暂时不用的可以用 ml 试管分装为 1 ml 保存( -20 ℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理( 1 %双氯硅烷/ 氯仿浸泡 1 小时, 烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水, 随后再用 ?m 微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。制备好的胶体金保存寿命较长,可 4℃保存 6 个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1 、单宁酸/ 柠檬酸钠法制备 3~ 16 nm 胶体金(1) 取一 250 ml 三角瓶,加入 79 ml 双蒸水和 1 ml1 %氯化金,预热至 60~ 70℃。(2) 取一 50 ml 烧杯, 加入 4 ml1 %柠檬酸钠, 然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的 25 mM K 2 CO 3。预热至 60~ 70℃。K 2 CO 3 的作用是保持溶液的中性 pH 。因此如果单宁酸的量少于 ml 时,对 pH 的影响不大, K 2 CO 3 可以省略。(3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温 10 分钟。自然冷却。浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 2 柠檬酸钠( ml ) 单宁酸( ?l) 胶体金( nm ) 45 000 3 42 000 4 45 006 4 12 08 470 10 410 16 2 、白磷还原法制备 5 nm 胶体金(1) 取 250 ml 三角瓶一个,加 79 ml 双蒸水, 1 ml 1% 氯化金,并用 0 .25 MK 2 CO 3将溶液调至中性( pH )。(2) 取 ml 饱和磷/ 乙醚溶液加到 ml 试管中, 再加 ml 乙醚, 混匀。取 ml 加入溶液( 1 )中( 磷有毒且易燃,操作请带手套,多余的磷溶液用 CuSO 4 进行中和)。(3) 室温下轻轻摇匀 15 min ,然后加热沸腾并保持 5 min ,自然冷却。 3 、柠檬酸三钠法制备 12-30 nm 胶体金(Frens, 1973) (1) 取 250 ml 三角瓶一个,加 100 ml 双蒸水及 1 ml 1% 氯化金,加热沸腾; (2) 取不同量的 1% 柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀, 再保持沸腾 30 min , 溶液颜色首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。注意: 柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm) 5 12 4 16 3 24 30 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 3 (1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差,以及制备过程中的其它问题,胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大,粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。(2) 胶体金溶液最好保存在 4℃冰箱