红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验.doc

红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验流感病毒表面的血凝素(HA)蛋白,含有识别与结合宿主细胞表面受体的结构,能使一些特定的红细胞发生凝集现象。当红细胞与病毒按适当的比例混合后,由于病毒的作用使红细胞发生凝集,此为凝集现象。含有特异的抗流感病毒HA蛋白的抗血清,能抑制红细胞凝集现象的出现,即抗体与病毒结合后,可以使血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上,此为红细胞凝集抑制(HAI)。微量红细胞凝集抑制试验就是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型及分析流感病毒HA抗原性变异的试验方法,也可以用于对一般人群抗体水平的检测与疫苗效果的评价等方面。用于HAI试验的标准参照血清必须及时更新,用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年的国际疫苗株或国内流行代表株的抗血清,可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物的抗血清;用于抗原分析的抗血清建议包括同一型别与亚型不同毒株免疫的标准参考抗血清,由于用雪貂制备的抗流感病毒血清特异性高,易将不同毒株间抗原性差异显示出来,因此常用免疫雪貂的抗血清进行抗原分析。HAI试验中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。(一)生物安全要求所有有关试验操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行,必须遵守生物安全规定,严格执行标准操作规程与废弃物管理规定,做好个人防护要求。季节性流感病毒病毒或经完全灭活的高致病性禽流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行,高致病性禽流感病毒的操作在BSL-3级实验室中进行。(二):以国际疫苗株与国内流行株作为标准参考抗原,新分离的毒株作为待测抗原。标准参考抗血清:以国际疫苗株与国内流行株制备的抗血清作为标准参考血清。血清要经RDE处理。(三)其她试剂/材料/仪器红细胞悬液 PH7、4的PBS缓冲液RDE(日本生研) 水浴箱(37℃,56℃)台式离心机 多道可调加样器、单道可调加样器离心管96孔微量血凝板(使用豚鼠与人红细胞进行实验须用“U”底板,使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板)200µL、1000µLTIP头、水槽表1、流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞火鸡豚鼠人“O”型血终浓度0、50、50、5孔底部形状V型U型U型孵育时间25-30min45-60min45-60min红细胞沉积形状细胞沉积成点状,倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状(四)流感病毒鉴定与抗原分析步骤实验前准备标准参考抗血清的处理去除血清中的非特异性抑制素所谓抑制素就是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质,它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别与结合。目前所知道的非特异性抑制素,除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊的非特异性抑制素,还有三种:α、β与γ。在HAI试验中,必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净,才能准确地测定出HAI的抗体效价。常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液(RDE,受体破坏酶的一种)清除法,过碘酸钾清除法等。RDE处理步骤:用25mL生理盐水稀释RDE;在1体积血清中加入3体积RDE(如0、1mL血清+0、3mLRDE),37℃水浴16-18h;56℃水浴30min;加入6体积生理盐水(在0、4mLRDE与血清混合物中加入0、6mL生理盐水)。去除非特异性凝集素向20体积RDE处理后的血清中加入1体积的纯血球。完全/彻底混匀