mTOR抑制剂的筛选方法.doc

mTOR抑制剂的筛选方法【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR是细胞生长增生的中心调控者,直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来,有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加,设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂的筛选方法进行简单的介绍。【关键词】雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素靶蛋白抑制剂药物筛选TOR(targetofrapamycin,雷帕霉素靶蛋白)是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族,广泛存在于各种生物细胞中。1994年,Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因,其产物只有一种蛋白,即mTOR(mammaliantargetofrapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR属P13K蛋白激酶类家族,是P13K/PKB信号通路下游的一个效应蛋白,其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关的蛋白质的合成。mTOR控制细胞mRNA的翻译,参与膜蛋白转运,蛋白质降解,蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病理过程。mTOR的分子结构mTOR分子结构复杂,由2549个氨基酸残基组成,分子中有数个各自独立而保守的结构域,类似于酵母中TOR的结构。mToR分子的氨基端存在20个串联重复序列,每一个重复序列包含2个分别由40个氨基酸残基组成的α螺旋,每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用,并有利于mTOR定位于浆膜。mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域,结构和P13K激酶的催化域相似。蛋白激酶域的上游是FRB域,为FKBPl2一雷帕霉素复合物与mTOR相互作用的区域,该区发生突变后可以完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用。FRB下游大约500个氨基酸残基处为FAT域,作用可能是与mTOR分子末端的FATC域形成一个空间结构,从而暴露mTOR分子的催化域。FATC域和NRD域位于mTOR分子羧基末端,其中NRD域在FATC和激酶催化域之间,是mTOR的负性调节域,而FATC域对mTOR的活性有着至关重要的作用,FATC结构中任何一个氨基酸残基的缺失都能使mTOR丧失催化能力。由于mTOR包含的几个相对独立的结构域都能够和其他蛋白质发生作用,因而其能结合不同的蛋白质。实际mTOR存在两种复合物形式,这两种复合物的结构在细胞中都是相对保守的。mTOR形成的两种不同复合物——mTORC1和mTORC2。已知的mTOR对肿瘤细胞生长、分化和代谢的作用均由mTORC1完成,mTORC2对雷帕霉素不敏感。FRB区,这个区域为免疫抑制剂FK506结合蛋白与雷帕霉素的结合位点,是雷帕霉素与mTOR相互作用的区域。所以这个区域突变后可完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用,FRB区之后为激酶区,作用是使丝氨酸苏氨酸发生磷酸化。最后的FATC为FAT碳末端区。FAT和FATC区可调节mTOR激酶的活性。mTOR的信号转导通路mTOR可通过P13K/AKT途径或AMPK途径来发挥作用。目前研究较多的是P13K/AKT途径。该途径在肿瘤中常被过度激活,使细胞周期调节失控,引起细胞转化和肿瘤进展。正常情况下,生长因子诱导mTOR的活化是通过激活P13K实现的。P13K可磷酸化肌糖环3-羟基的磷酸肌醇。细胞膜3-磷酸磷脂(P13Ps)与Akt的PH区域连接,导致Akt转位至浆膜,从而与磷酸肌醇依赖性激酶1(PDKl)接触。PDKl负责Akt的磷酸化,从而激活Akt。激活的Akt可磷酸化结节性硬化复合体2(TSC2)并减弱后者对mTOR的抑制作用。Akt和P13K在功能上属于原癌基因,受到抑癌基因PTEN的负性调节。PTEN可使肌糖环3-羟基的磷酸肌醇磷酸化,在胚胎发育、细胞迁移、凋亡和有效终止P13K介导的信号转导方面起着关键性的作用。PTEN突变在人类实体肿瘤非常常见。活化的P13K位于细胞膜,可催化磷脂酰肌醇P2转变为磷脂酰肌醇P3,后者募集并激活AKT。PTEN可以下调PtdlinsP3的浓度。从而抑制P13K/AKT途径。AKT对mTOR的激活主要通过以下两种方式:一种是磷酸化mTOR而直接激活它;另一种是磷酸化并抑制TSC1/TSC2二聚体。TSCl/TSC2是mTOR最重要的上游信号分子。Rheb是mTOR激活蛋白,TSCl/TSC2二聚体通过抑制Rheb阻止mTOR的活化。由于P13K/Akt/mTOR通路分子发生突变或者上游信号通路分子激活,肿瘤细胞P13/Akt/mTOR通路可被激活,从而使细胞增殖失控、凋亡抗拒以及引起细胞的代谢改变。mTOR经过上述两种途径被活化后可将信号传递给下游通路,通过两种途径调节下游核糖体和mRNA结合,一是使抑制