1总RNA提取(1)液氮研磨或冰上匀浆实验材料;先将1mlTrizol加到离心管中待用(2)将研磨好的样品加到离心管中混匀,室温放置5min;打开离心机预冷(3)加200µL氯仿,振荡15sec,室温放置3min,分层;(4)4oC,12,000g,离心15min;(5)取上清,加500μL异丙醇,混匀,室温放置10min;(6)4oC,12,000g,离心10min;(7)弃上清,加1mL75%乙醇,漂浮洗涤沉淀,振荡充分;再用100%乙醇清洗(8)4oC,7,500g,离心5min;(9)弃上清,离心,用枪吸取多余液体,放在超净台里干燥后,加50μLDEPC水,-80oC保存。此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA电泳检测质量,并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值,OD280值为蛋白的吸收值,OD260/-,可正常使用;此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值,比较干净的核酸OD260/。RNA浓度计算公式:总RNA浓度(µg/mL)=A260×稀释倍数×40。2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA,操作按TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentwithgDNAEraser(PerfectRealTime)说明书进行。其体系为:TotalRNA1μg5×gDNAEraserBuffer2μLgDNAEraser1μLRNaseFreedH2O补齐至10μL条件为:42oC,2min;RNA纯化后,即可进行反转录。其体系为:5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)4μLPrimeScriptRTenzymemixⅠ1μLRTPrimerMix1μL上一步的反应液10μLRNaseFreedH2O补齐至20μL操作条件为:(1)37oC放置15min;(2)85oC,5sec;(3)4oC保存。,,PCR反应体系如下:PremixTaq25μL模板5μL引物1(10μM)1μL引物2(10μM)1μLddH2O18μLPCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性30s,53°C退火30s,72°C延伸30s,循环36次;72°C延伸10min。PCR反应完毕,取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(若割胶回收则用10μL反应产物)。%琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的UniversalDNAPurificationKit割胶回收试剂盒进行纯化,步骤如下:(1)平衡吸附柱:向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL,13,400×g离心1min,倒掉收集管中的废液,吸附柱CB2重新套回收集管中;(2)按100mgagarose胶加入100μL溶液PC,置于50oC中10min左右,中途混匀几次,至胶完全融化;(3)将样品倒入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中),室温下13,400×g离心1min,倒掉收集管中的废液,吸附柱CB2重新套回收集管
基因克隆步骤完整版 来自淘豆网m.daumloan.com转载请标明出处.
