基因克隆步骤完整版.docx

1总RNA提取
(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料;先将1ml Trizol加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀,室温放置5 min;打开离心机预冷
(3) 加200 µL氯仿,振荡15 sec,室温放置3 min,分层;
(4) 4oC,12,000g,离心15 min;
(5) 取上清,加500 μL异丙醇,混匀,室温放置10 min;
(6) 4oC,12,000g,离心10 min;
(7) 弃上清,加1 mL75%乙醇,漂浮洗涤沉淀,振荡充分;再用100%乙醇清洗
(8) 4oC,7,500g,离心5 min;
(9) 弃上清,离心,用枪吸取多余液体,放在超净台里干燥后,加50 μL DEPC水,-80oC保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA电泳检测质量,并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值,OD280值为蛋白的吸收值,OD260/-,可正常使用;此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值,比较干净的核酸OD260/。RNA浓度计算公式:总RNA 浓度(µg/mL)=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成
纯化RNA以去除基因组DNA,操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为:
Total RNA
1μg
5× gDNA Eraser Buffer
2μL
gDNA Eraser
1μL
RNase Free dH2O
补齐至10μL
条件为:42oC,2min;
RNA纯化后,即可进行反转录。其体系为:
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4μL
PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ
1μL
RT Primer Mix
1μL
上一步的反应液
10μL
RNase Free dH2O
补齐至20μL
操作条件为:
(1) 37oC放置15 min; (2) 85oC,5 sec; (3) 4oC保存。
3 PCR
按TaKaRa公司的Premix Taq Version ,,PCR反应体系如下:
Premix Taq
25 μL
模板
5μL
引物1 (10 μM)
1 μL
引物2 (10 μM)
1 μL
ddH2O
18μL
PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性30s,53°C退火30s,72°C延伸30s,循环36次;72°C延伸10min。
PCR反应完毕,取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(若割胶回收则用10μL反应产物)。
4 基因克隆及测序
PCR产物切胶回收
将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化,步骤如下:
(1)平衡吸附柱:向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入50